液滴微流体作为一种新兴技术，可以在微纳米尺度上实现对流体的精确控制，以生成高单分散(CV)和高重复性的微液滴。基于此种技术，可以制备多种微粒：微胶囊、水凝胶微球、功能聚合物粒子和量子点微球等，从而为诊断学、制药学、化妆品和免疫层分析技术等领域提供更多的便利。

尽管液滴微流控技术具有以上如此多的优点，但其单个制备单元的产量较低，一般流量在0.1~10 mL/h，这严重阻碍了液滴微流控技术在工业化上的广泛应用。而传统乳化技术如高速搅拌、均质、超声和膜乳化等方法具有操作简单和成本低等优点，可以实现较高的产量；但其缺点也是明显的：生产粒径分布较宽(CV<30%)。

相较之下，在保证微液滴高单分散(CV<5%)下，集成上千甚至上万个微流控液滴生成单元同时运行更能满足工业应用的需求。随之而来的问题是，需要投入大量的流体泵、压力控制驱动装置及相关的基础设施，这将会极大提高投资成本，且操作难度也会大大提高。因此，液滴微流控的集成放大成为了液滴微流控技术面向工业应用的技术难点。

FludicLab高通量液滴微流控平台，只需一台两通道压力控制器，一只玻璃芯片和对应夹具便完成了四路微流控液滴单元并联的高单分散性(CV=3.44%)和高通量(12 mL/h)微液滴生成。

四路微流控液滴单元并联的微液滴生成视频，油相：2%氟油，水相：墨水

显微镜下观察到的收集的微液滴

收集到的微液滴粒径统计图

FluidicLab致力于提供专业标准的微流控解决方案，如有需求，请直接联系我们哦：021-65103566 / 13661425419 或 邮箱：sale@fluidiclab.com。

➤ 1.引言

作为生命的物质基础，蛋白质参与了体内细胞的生长和黏附、免疫应答和催化等过程，是生命活动的主要承担者^[1]。在内部基因和外界环境的共同作用下，蛋白质表达与否及表达量的差异将直接影响着疾病发生、神经传导和免疫应答等^[2]。因此，蛋白表达分析对分子机制研究、疾病的临床诊断和治疗以及药物的开发等方面都极其重要^[3]。早期的蛋白组学分析方法如质谱、免疫分析和双向电泳等技术，往往需要大量的细胞，检测结果反映的是细胞群体的平均蛋白表达水平^[4]。然而，拥有相同基因组信息的细胞在蛋白表型上存在显著的异质性。基于组织水平的蛋白组分析更易忽略细胞个体间的差异，而细胞的异质性在癌症转移和干细胞分化等方面起至关重要的作用^[5]。随着技术的发展，更多的研究结果表明单细胞中DNA、mRNA转录和蛋白表达水平相关性较差，这严重限制了从DNA和mRNA角度来评估蛋白质组学信息的能力^[6,7]。 对于一个细胞水平的生物过程，往往是由多个基因之间相互作用的结果所致。因此，单细胞水平上的蛋白表达研究更能揭示大量不能通过单个基因或组织水平研究解释的现象，是理解基因组与细胞反应之间的重要桥梁。单细胞蛋白组分析能够从大量细胞中区分和识别那些罕见但重要的细胞，有助于临床诊断、药物研发和某些重要的分子机制的研究^[5]。与基因表达分析相比，测定单细胞中蛋白组的难点在于蛋白质种类复杂，且含量非常低，蛋白质无法像DNA和RNA那样能以极快的速度实现扩增^[7,8]。因此，单细胞蛋白组分析应当具备多重分析性能、高吞吐量和高灵敏度等特点^[9]。在这其中，多重分析性能决定了单细胞蛋白组中的蛋白数量，吞吐量决定了并行分析的细胞数量，灵敏度决定了检测分析样本的浓度下限^[4]。而在这方面，基于质谱的无抗体标记技术有望解决单细胞蛋白组学面临的以上问题。最近有文献报道指出，采用新兴的单细胞蛋白组学质谱技术(SCoPE-MS)及其第二代(SCoPE2)技术可以实现对数百个单细胞样本中数千个蛋白进行定量分析^[10]。然而，单细胞蛋白组学仍存在一些问题，如单细胞样本与设备连接困难，样本处理需精度高(样本微小损失会严重影响检测结果)，需同时对大量单细胞进行分析以减少固有噪声等^[11,12]。以上这些问题无法通过简单的修改传统的基于单细胞蛋白组分析的方法和常规样品处理技术很难解决。 微流控是一种对微纳米尺度上的流体进行控制新兴技术^[13]。微流控芯片中流道微米级尺寸恰好与细胞匹配，这使得微流控成为单细胞分析(包括单细胞蛋白组分析)的理想平台^[14]。微流控技术本身虽不是一种分析手段，但它能有效避免样品过度稀释(降低检测限)，显著提高了样品吞吐性能(以便获得足够数据进行重要统计)，并大幅度降低了成本，是一种有效的单细胞蛋白组学分析方法^{[15, 16]}。近年来，基于微流控的各种不同单细胞蛋白组学分析方法不断被报道，且部分方法已实现商业化。因此，本文将着重对最新报道的方法、及应用和优缺点进行系统的阐述，并对目前的商业发展进行简要回顾。

➤  2.基于微流控技术的单细胞分析方法

2.1 单细胞条码芯片 为了对单细胞蛋白组进行全面的分析，Ma等开发了一种基于阀门控制的PDMS单细胞条码芯片(single-cell barcode chip, SCBC)^[17]。此芯片由一张装有13组垂直阀门的PDMS层、一张含有80组水平的微通道(横截面尺寸为100 µm × 17 µm) PDMS层和一张具有条码阵列的玻璃基底三部分自上而下组装而成(图1A-a)。通过将上层和中层的两个PDMS层交错以形成1040个微室用于载入单个细胞。下层玻璃基底上的条码阵列是一条条平行条带，每一条带首先利用DNA编码抗体文库(DNA-encoded antibody library, DEAL)法^[18]结合特异性抗体，即分别将不同序列的单链DNA分子固定在不同条带上(条带表面有聚胺涂层)，再利且碱基对互补作用连接上偶联了抗体的另一条单链DNA分子，这一作法避免了抗体直接连接降解的问题；然后，利用控制阀门将细胞随机载入一千多个微室中，每个微室载入的细胞个数从零到几个不等，其细胞载入数量符合泊松分布(图1A-b)；分散于各个微室中的单细胞分泌的蛋白继而由微室内特定DNA编码的抗体库所捕获；随后，捕获的蛋白会通过三明治法进行荧光免疫分析测定，也即是捕获的蛋白与生物素标记的抗体结合，再利用链霉亲和素进行荧光标记，最终通过荧光强度对蛋白组进行检测分析(图1A-c)。结果表明，这种方法具有高的样品效率和高的灵敏度，能同时定量检测十多种单细胞分泌蛋白组，并提示了表型相似T淋巴细胞的高度功能异性。在此基础上，该方法经过改进被用于各种单细胞分泌蛋白的定量研究，如人类肿瘤细胞系^[19]和原代细胞^[20]。为了进一步提高单细胞蛋白组多重分析性，Lu等将空间和光谱编码与PDMS微腔相结合，能实现同时对单细胞分泌的42种免疫效应蛋白进行检测^[21]。此外，也有报道利用SCBC芯片用于单细胞分泌蛋白对细胞间相互作用以及信号转导影响的研究^[22,23]。 除了单细胞分泌蛋白组分析外，Wang等将该法扩展到基于无阀控制的SCBC来分析检测单细胞(包括膜蛋白、细胞内和分泌蛋白)，以此量化细胞间相互作用^[24](图1B)。此芯片由一张含有8700个微室的PDMS层和一张具有高密度条码阵列的玻璃基底组成。上层PDMS层的8700个微室共被分成435组(20个/组)，在每组的中间位置有一条贯穿的微通道，微通道两侧各分布10个微室(图1B-a)。PDMS层与具有条码阵列的玻璃基底键合时主要是通过可压缩变形(利用压力改变)的微柱接触。如图1B-b所示，在无压力状态(Fully open)下，向SCBC中通入足够数量的细胞以确保每个微室随机载入0~3个细胞；载入细胞后调整压力使微柱变形收缩至Close state II以此封装细胞于微室内培养；经培养一段时间，期间单细胞分泌蛋白被特定的抗体阵列所捕获(图1B-c)。而关于细胞质或膜蛋白组分析，首先施加压力使微柱处于Close state I，在微通道内通入裂解缓冲液裂解细胞，而裂解缓冲液会被引入微室内(此时状态细胞无法移动到微室外)；细胞裂解后的细胞质或膜蛋白组同样被特定的抗体阵列所捕获，然后通过荧光免疫分析对蛋白组进行测定(图1B-c)。结果表明，在一定培养时间内，细胞在短距离时会产生抑制作用，在较大距离时主要产生激活作用。

图1  |  A、用于单细胞分泌蛋白组分析的SCBC设计图：a. SCBC装置图，b. 微室放大图(图中数字代表微室中细胞数)，c. DEAL法捕获分泌蛋白进行免疫测定；B、用于单细胞综合蛋白组分析的SCBC设计图：a. 无阀控制的SCBC装置图，b. 单细胞分析流程图，DEAL法捕获分泌蛋白、细胞质蛋白或膜蛋白进行免疫测定，c. DEAL法捕获蛋白进行免疫测定，d. 微室放大图，e. SCBC对分泌(IL6)和细胞质(p-Erk)蛋白的荧光数据。‍

此外，有关罕见细胞纯化以及蛋白组学分析也有报道。如Shi课题组设计开发了一种结合SCBC集成的微流控系统应用于罕见单循环肿瘤细胞(CTCs)纯化及分泌蛋白组学分析研究^[25]。CTC分离纯化和单细胞蛋白组分析的整个系统主要包括：CTC捕获芯片(包括紫外灯)、红细胞(RBC)捕获芯片、白细胞(WBC)捕获芯片和SCBC芯片(图2A)。其原理如图2B所示，将含有单链ssDNA编码特异性抗体(含有光解连接物)标记的CTC全血样本通入CTC捕获芯片中，而CTC表面的单链ssDNA会与芯片上固定的单链ssDNA互补而被捕获；待细胞被捕获后，将CD45(普通白细胞抗原)和CD15(粒细胞标记物)包被的免疫磁珠的混合物通入芯片中，并与非特异性结合的白细胞结合；随后将芯片暴露在紫外灯下短时间暴露以将释放固定在芯片中的CTC；接着将其流入到RBC捕获芯片即螺旋芯片中，通过调控流速(控制离心率)以除去RBC；然后将其流入到WBC捕获芯片，利用磁铁除去与磁珠结合的WBC；最后，将高纯度的CTC流入到SCBC芯片，以便使得集成的聚赖氨酸(PLL)条形码对单个CTC进行捕获来完成分泌蛋白组学分析研究。在这其中，合成可光降解的单链ssDNA编码特异性抗体是为了在不损害细胞活力下高效捕获和释放CTC。结果表明，这种结合SCBC芯片集合的微流控系统有效的实现了对CTC的分离和纯化，且CTC表现出高度的异质性。

图2  |  A、实验装置和微流控芯片；B、CTC分离纯化和单细胞分泌蛋白分析的示意图。‍

采用SCBC分析具有样本量小、灵敏度高、范围广(包括膜蛋白、胞内和分泌蛋白)和多重分析能力等优点。尽管如此，但它仍有一些问题需要改进。如芯片的微阀制造复杂，操作复杂，有限的条码微芯片面积限制了其检测的吞吐量等。此外，多重分析能力与检测灵敏度之间需保持平衡，即多重分析能力越大反而会导致分析灵敏度的降低。 2.2 液滴微流控技术 采用液滴微流控技术可将单个细胞封装在小的液滴内以分离和研究细胞表面膜蛋白组及其分泌蛋白组。与其他方法不同的是，单细胞被封装在悬浮于油相中的液滴中，细胞空间的隔离有效避免了蛋白组的扩散^[26]。此外，水相确保了培养细胞的正常生理条件，而常用的氟油由于具有较高溶氧量则更利于细胞的培养^[27]。因此，基于液滴的微流控技术在单细胞蛋白组学分析的报道层出不穷。

图3  |  A、利用测序对转录组和表位进行细胞索引(CITE-seq)；B、RNA表达和蛋白测序分析(REAP-seq)^[28], R1: read 1. R2: read 2。 Stoeckius等人介绍了一种基于液滴微流控技术，通过测序对转录组和表位进行细胞索引(cell indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing, CITE-seq)的方法^[29]。其操作流程如图3A所示，首先利用生物素和链霉亲和素将特异性抗体与寡核苷酸链(包括PCR handle、Ab barcode和捕获DNA序列，其中Ab为抗体，捕获序列能和beads上的序列互补配对)连接；随后，利用传统的流式细胞术用DNA标记的特异性抗体对细胞进行免疫染色；然后采用液滴微流控技术将单细胞、带有条形码的beads及试剂共同封装在液滴中；通过细胞裂解并还原二硫键将寡核苷酸链与特异性抗体断开，细胞中的mRNA序列和标记特异性抗体的DNA序列与beads上的条形码互补配对；随后，mRNA序列和标记特异性抗体的DNA序列利用逆转录同时通过延伸杂交形成互补链；然后，通过PCR扩增对转录组和蛋白组衍生物进行分离以确保文库的相对比例可分别调整；最后，对这两个文库进行测序，并在分析过程中对单细胞蛋白组学和转录组学数据进行分组研究。同年，Peterson等人也提出了RNA表达和蛋白测序分析(RNA expression and protein sequencing, REAP-seq)(图3B所示)^[30]。这种方法与CITE-seq非常相似，但两者的不同点在于寡核苷酸与抗体结合方式由胺类代替原来的生物素和链霉亲和素。这一区别也决定了寡核苷酸与抗体是否能断开。以上这两种技术都适用于单细胞转录组分析的所有液滴微流控技术，然而，其局限性在于只能对细胞表面膜蛋白组进行测定分析。

图4  |  Abseq^[28], R1: read 1. R2: read 2.

除此之外，Abate 课题组也设计出了Abseq^[31]。这种方法与CITE-seq和REAP-seq相比有些许相同之处，如：用捕获DNA序列标记抗体，且在微流控封装之前用经DNA序列标记的抗体免疫染色细胞，随后对扩增的文库进行测序和数据分析。然而，此法也有不少差异。具体如下：在Abseq中，液滴微流控处理总共三个操作过程(即三个芯片)。首先，利用微流控芯片分别生成两种液滴：一种是单细胞液滴，另一种是条形码引物液滴；其中，单细胞液滴封装DNA标记抗体(利用异双功能交联剂将抗体和寡核苷酸链，寡核苷酸链是由PCR handle、UMI、抗体条码和捕获序列组成)免疫染色的细胞和蛋白酶(用于细胞裂解)，条形码引物液滴封装一个DNA序列、PCR试剂及引物混合物，然后通过PCR扩增以实现条形码扩增(每个条形码包含细胞条形码和捕获序列组成)；然后，在第三个芯片中生成含有PCR扩增的液滴并与前两个芯片产生的液滴按1:1:1的数量混合；在其混合后每个液滴(非常大且不稳定)被分成四个相等的液滴以进行热循环和PCR扩增；Abseq的优点是在于蛋白酶K裂解细胞后使其失活以免后续细胞裂解物抑制PCR反应。这种方法只适用于单细胞表面膜蛋白组分析，而不适用于mRNA分析。 液滴微流控技术具有独特的优势，一方面可以将单细胞限制在液滴内通过测序的方式对细胞表面膜蛋白组进行分析，另一方面也可以基于荧光液滴微流控技术对单细胞分泌蛋白进行测量以此降低成本。迄今为止，已开发了许多基于荧光的液滴微流控技术用于单细胞分泌蛋白组的工具。通常情况下，将单细胞与捕获结构共同封装在液滴中进行细胞培养，细胞分泌的蛋白后会被捕获结构所捕获^[5]。捕获结构一般分为两部分：一部分(特异性抗体或适配体)用于与细胞分泌蛋白特异性结合，另一部分被固定在载体上(如珠子、细胞表面)。 Qiu等人通过直接在细胞膜表面锚定适配体用于捕获细胞分泌蛋白，其优点是所有的操作都是在液滴中进行的，从而能随着时间变化监测细胞分泌蛋白的产生^[32](图5A所示)。其原理如下：首先，通过胆固醇将配体探针与细胞表面的磷脂层连接，而适配体探针两端分别用荧光团和猝灭剂标记；随后，通过液滴微流控技术将带有配体的细胞封装在液滴内。在没有细胞分泌蛋白存在下，配体自杂交形成发夹结构，使荧光团和猝灭剂保持在很近的距离，从而导致荧光的猝灭；当捕获细胞分泌蛋白时，适配体探针转变为一种特定的三级结构，荧光团和猝灭剂被分开，从而导致荧光信号的增强。 Wimmers等人利用锚定在细胞表面的双功能结构抗体捕获细胞分泌蛋白^[33](图5B所示)。在这种情况下，利用液滴微流控技术将锚定抗体的细胞与相应试剂封装，经培养后，细胞产生的分泌蛋白被细胞表面锚定的双功能结构抗体捕获；待破乳后，引入的荧光标记抗体会与细胞表面所捕获的分泌蛋白结合完成分析检测。 此外，也有文献报道通过将捕获细胞分泌蛋白的抗体固定在聚苯乙烯珠上完成分泌蛋白的捕获和分析检测^[34]。具体操作如图5C所示，首先，利用液滴微流控技术将单细胞和分泌蛋白捕获珠共同封装在单分散的琼脂糖液滴中；经封装和孵育，细胞分泌蛋白与聚苯乙烯捕获珠上的抗体结合，并实现琼脂糖液滴的固化；破乳后，获得的琼脂糖珠用荧光标记的抗体染色并通过流式细胞术检测分泌蛋白。

图5  |  基于液滴微流控技术用于单细胞蛋白组的分析研究。A、细胞膜锚定适配体探针用于捕获分泌蛋白；B、细胞膜锚定抗体用于捕获分泌蛋白；C、抗体标记的捕获珠用于捕获分泌蛋白^[28]。 基于液滴微流控技术用于分泌抗体的免疫细胞研究也有较多报道。如Mazutis等利用捕获珠表面的荧光信号对抗体分泌细胞进行分类^[35]。具体流程如图6A所示，首先将单细胞、涂有Anti-IgG抗体的捕获珠和荧光标记的探针一起封装在液滴中；经芯片外培养后，细胞分泌感兴趣的抗体与被捕获珠所捕获；随后，荧光标记的探针与捕获的抗体结合从而定位在捕获珠表面；最后，将乳液重新注入芯片中，并通过捕获珠上局部荧光信号用于高通量筛选抗体分泌细胞。 Eyer等人通过DropMap (droplet-based microfluidic technology)研究单细胞分泌抗体结合特定抗原随时间的变化(图6B所示)。其原理如下：将单细胞、1300个涂有捕获分子的磁纳米颗粒、荧光标记的检测抗体与荧光标记的抗原一起包封在液滴内。随后，将液滴固定在观察室中，在磁力的作用下形成2D液滴阵列结构，并用荧光显微镜进行成像观察；单细胞分泌的抗体与捕获珠结合，并通过与荧光标记的检测抗体结合来显现；此时，施加的磁场会在每个液滴中诱导形成细长、容易观察的纳米颗粒聚集体即珠线；单细胞抗体分泌率可通过标记抗体的荧光强度来观察，而抗体对抗原的亲和力则通过标记抗原的荧光强度来测定。

图6  |  不同液滴微流控技术在单细胞分泌抗体上的应用有研究。A、 分泌抗体细胞的筛选，B、采用DropMap用于抗体分泌和抗体对特异性抗原的亲和性研究^[28]。

本文延续本网站上一篇文章：

【微流控技术前沿：中枢神经系统类器官/器官芯片模型】

本系列总体章节目录：

章节一． 中枢神经系统体外模型概述

章节二． 使用hiPSC构建中枢神经系统体外模型：优势和挑战

章节三． 类器官/器官芯片中枢神经系统体外模型介绍

章节四． 基于类器官/器官芯片的中枢神经系统疾病模型

章节五． 商品化的类器官和器官芯片系统使用指南‍

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章节二、使用hiPSC的中枢神经系统体外模型：优势和挑战

诱导多能干细胞由终末分化的体细胞经诱导产生，其功能类似于胚胎干细胞，使用人源诱导多能干细胞可以避免干细胞使用上的伦理问题，因此在转化医学中得到广泛的应用 （Yu et al., 200；Loh et al., 2009；Polo et al., 2010；Halevy and Urbach, 2014；King and Perrin, 2014；Choi et al., 2015；Shi et al., 2017；Volarevic et al., 2018）。

来源于健康人和患者的体细胞可被重编程为干细胞，这些干细胞可再分化为特定细胞类型，移植到患者体内（Sa´nchez Alvarado and Yamanaka, 2014）。然而，将hiPSC应用到中枢神经系统治疗中仍面临巨大的挑战（Braganc¸a et al., 2019；Ortuno-Costela et al., 2019）。这些挑战一方面由于脑组织结构上的复杂性，另外一方面是因为免疫反应（即使是在自体来源的情况下），往往导致中枢神经系统移植失败（Zhao et al., 2011；Nikolakopoulou et al., 2016；Garreta et al., 2018）。这些体内尝试的结果充分证明了建立有效的个性化中枢神经系统体外模型的必要性。

来自正常和病患的hiPSC已被用于模拟人类脑组织，以阐明其在正常和病理环境中的功能和机制。hiPSC与器官芯片结合，使研究人员能够复现人类中枢神经系统的复杂结构，如血脑屏障 （Vatine et al., 2019）。基于hiPSC的脑芯片设备通常被用于研究神经发育和神经退行性病变，为再生医学、毒理学和高通量研究进展做出了重大贡献 （Berg et al., 2019）。但是，在研究人员试图将hiPSC细胞整合到体外平台中时，仍然面临着多种障碍。

目前构建基于hiPSC的先进体外模型面临的挑战：

1. 供体多样性和细胞异质性

供体多样性是原代细胞共有的特征，是构建hiPSC体外模型中的主要障碍。在重编程和分化过程中残余的表观遗传记忆、特殊的遗传背景导致了hiPSC衍生细胞系之间的巨大多样性 （Kim et al., 2010, 2011；Polo et al., 2010；Bar-Nur et al., 2011；Boland et al., 2014）。由于不完全的重编程，一些hiPSC细胞系显示出增殖和分化潜能的缺陷 （Ohnuki et al., 2014）。

2. 分化步骤、重复性和细胞成熟度

可靠的模型需要高质量的hiPSCs和有效的分化方案，以达到预期的细胞命运。因此，学术界和工业界的研究人员一直致力于开发中枢神经系统谱系特异性分化步骤。然而，对纯细胞和成熟细胞类型的需求在很大程度上仍未得到满足。这些细胞经常表现出不成熟的、具有胚胎组织属性的特征。这些细胞可以作为神经发育和早发性疾病研究的良好模型，但不能充分模拟晚发性疾病和成熟组织 （Miller et al., 2013）。一些研究已经报道了由于残留的表观遗传记忆，hiPSCs偏向于分化为特定谱系的细胞。通过增加分化前的传代数，可以将这些细胞重置为多潜能模式 （Polo et al., 2010；Bar-Nur et al., 2011；Kim et al., 2011；Boland et al., 2014；Kedziora and Purvis, 2017；Doss and Sachinidis, 2019）。总的来说，为了提高基于iPSC的体外模型的可转化性，生产高质量的hiPSCs仍然是一个关键问题。

3. hiPSC来源细胞的免疫原性

早期在动物身上进行的研究 （de Almeida et al.,2014；Zhao et al., 2015）表明，分化细胞的免疫原性低于相应的iPSC群体。因为hiPSC可以规避生理免疫反应，避免患者的排斥反应，hiPSC来源的组织可以取代自体组织移植。然而，也有证据表明，hiPSC衍生的体外模型可能缺乏预测免疫反应方面的能力。在这种情况下，hiPSC衍生的模型无法很好地模拟脑组织中免疫介导的疾病，从而阻碍了药物的成功开发。

4. 使用基于hiPSC构建神经退行性疾病模型

使用hiPSCs对单基因疾病建模较为准确，但对于复杂的，多基因疾病和散发性疾病建模仍较困难。迄今为止，对于复杂的多基因疾病的研究方法是将患者和来自同一家族的健康成员进行比较；病变通常归因于同一家族中健康和病人比较后得到的突变，从而找到疾病原因。这种方法可以防止研究人员将疾病相关的变异与由其他因素引起的变异混淆起来。由于大多数神经退行性疾病都是散发性的，有必要使用大量患者来源的hiPSC来降低研究的信噪比，提高结果的准确性（Doss and Sachinidis, 2019）。此外，hiPSC衍生的细胞通常被用于2D培养，因此缺乏三维空间的相互作用；工程化的3D培养模型提供了类似于体内的环境，以方便研究遗传和环境线索如何影响疾病（Sharma et al., 2020）。

5. hiPSC来源细胞的区域特性

人类中枢神经系统的复杂性来自于多个神经细胞亚型之间的相互作用。而大多数神经系统疾病源于特定细胞亚型的缺陷，其潜在机制在很大程度上仍难以确定 （Imaizumi et al., 2015）。因此，准确的疾病建模需要使用具有特定区域特性的分化细胞。事实上，世界各地的研究人员已经使用来自患者的hiPSCs来研究几种神经系统疾病，包括肌萎缩性侧索硬化症（ALS）、阿茨海默病、精神分裂症和帕金森病 （Cooper et al., 2010；Zhang et al., 2014；Ahmad et al., 2018；Fujimori et al., 2018；Henstridge and SpiresJones, 2018；Li et al., 2018；Mishima et al., 2018, Osaki et al., 2018c；Ishii et al., 2019；Penney et al., 2020）。在这些研究中，hiPSCs被分化为不同的细胞类型，从而提供了具有区域特征的细胞疾病模型。然而，由于目前的分化方案在高纯度培养各种神经元亚型方面的能力有限，在这些研究中获得的结论仍有很大的不确定性。

6. 对通用培养基的需要

对于基于器官芯片和iPSC衍生的体外模型来说，一个重要的问题是需要一种“通用培养基”。为了有效地模拟脑组织的多样性，经常需要共培养几种细胞类型。但是不是每个细胞都能在相同的培养基中生长，并对相同的生长因子或分化因素作出反应 （Pavlovich, 2018）。因此，需要研发无异源成分、组分明确的培养基，以支持iPSC衍生的细胞的生长和分化。

 

章节三、类器官/器官芯片中枢神经系统体外模型介绍

一、使用微流控芯片分区域培养细胞

微流控芯片的基本功能是创造一个各种细胞物理上相互分隔，但仍然可以相互作用的平台，从而实现在体内模型中无法实现的连续观察。这种分隔和相互联系可以通过连接几个器官芯片或在一个微流控芯片上集成多个单元实现。

将神经元胞体体与延伸的神经突进行物理分隔的概念首先由 Campenot提出 （Campenot, 1977）。2003年，Taylor等首次利用微流控技术，在细胞培养室中加入微凹槽；研究人员从而将神经元胞体和神经突触物理分开，并使用该系统来研究神经突触的局部损伤 （Taylor et al., 2003；Neto et al., 2016）。2005年Taylor率先开发了一种基于微流体的体外平台来研究损伤后的轴突再生 （Taylor et al., 2005）。Park进一步改进了该设备，以研究神经元-胶质细胞之间的相互作用和轴突髓鞘形成 （Taylor et al., 2005；Park et al., 2006, 2009a, 2012；Higashimori and Yang, 2012；Shi et al., 2013）。为了阐明髓鞘形成机制，科学家在同一系统内共培养神经元和神经胶质细胞，并应用于脱髓鞘疾病（多发性硬化症）的治疗策略研究 （Park et al., 2009b；Yang et al., 2012；Shi et al., 2013）。后续开发的系统将免疫细胞、hiPSC来源的小胶质细胞、hiPSC来源的少突胶质细胞也整合进来，旨在揭示人类脱髓鞘脑组织中发生的复杂细胞过程 （Abud et al., 2017；Douvaras et al., 2017；Haenseler et al., 2017；Pandya et al., 2017；Garcia-Reitboeck et al., 2018；McQuade et al., 2018）。

在多芯片设计中，几个器官芯片连接在一起，模拟神经组织复杂的细胞结构。例如，在人类神经血管单元（NVU）的模型中，通过将三个芯片联通在一起，揭示了内皮细胞和神经元细胞之间的代谢耦合（Maoz et al., 2018）。

微流体技术也被广泛用于探索生化因子如何影响轴突生长、寻径和突触功能（Wu et al., 2005；Cox et al., 2008；Taylor et al., 2009；Gumy et al., 2011；Park et al., 2014；Kung et al., 2015；Deglincerti et al. （2015）。Deglincerti利用轴突与神经元体细胞的物理分离，表明生长锥与局部蛋白质合成/降解的紧密联系。该研究表明，生长锥表现出整体泛素化水平的升高，并且蛋白降解复合体特异的降解生长锥特异表达的蛋白。因此，作者认为，轴突中引导信号的调节包含了局部特异表达蛋白的合成和降解 （Deglincerti et al., 2015；Neto et al., 2016）。

除了可以培养细胞群，并使细胞之间互相联系，器官芯片也可控制大量的机械特性如材料刚度、形状约束、间隙流和剪切应力，来研究他们对细胞状态和分化的影响 （Sundararaghavan et al., 2009；Peyrin et al., 2011；Song and Munn, 2011；Kim et al., 2013；Galie et al., 2014；Hattori et al., 2014；Asano et al., 2015；Osaki et al., 2018a）。各种生化因子也可以很容易施加在器官芯片上，以对神经发育过程的机制进行研究。通过操纵细胞因子的浓度梯度，如BMP4、SHH、FGF、RA和WNT3，即可协调细胞在早期脑组织发育中增殖、分化和器官发生 （Park et al., 2009b；Demers et al., 2016；Uzel et al., 2016；Osaki et al., 2018a）。

二、利用微流控系统来重现不同大脑区域及其连接

人类的大脑由250多个不同的区域组成，每个区域都有特异性的ECM、结构和功能（Dauth等（Novak and Kaye, 2000；Lau et al., 2013；Dauth et al., 2016）。高级的大脑功能，以及许多神经精神疾病，受海马、丘脑、小脑和杏仁核等多个大脑区域的相互作用调节 （Kato-NegiShi et al., 2013）。因此，在体外模拟不同脑区的连接具有重要意义。目前，只有少数的体外模型包含了来自两个或多个不同脑区的细胞 （Kanagasabapathi et al., 2011；Peyrin et al., 2011；Kato-NegiShi et al., 2013；Dauth et al., 2017；Soscia et al., 2017）。Peyrin等人报道了一个微流控系统，重建了一个具备功能和同步化的皮质-纹状体定向网络。使用双腔室的微流控装置培养小鼠原代皮质和纹状体神经元，并使它们通过轴突连接 （图2 A） （Peyrin et al., 2011）。研究人员借此观察到，皮质神经元触发了多刺纹状体神经元的分化和树突棘的形成。另外一种类似的微流控装置也被用于研究皮质和丘脑之间的相互作用 （Kanagasabapathi et al., 2011）；基于微流控芯片的系统操作简单，可以实现体内系统中难以实现的功能（如单独研究皮质-丘脑相互作用的能力，而不受其他区域的影响。在该模型基础上开发的体外模型可以生长神经突，连接两种不同的脑组织，进行电生理和免疫组化分析（Kanagasabapathi et al., 2012）。通过使用这个体外系统，作者证明了群体放电起源于皮层区域，然后触发了皮层-丘脑网络，证实了之前从体内实验中得到的结论。

Kato-Negishi等开发了一个毫米大小的三维神经元芯片，由大鼠海马和皮质细胞形成。在这个模型中可进行Ca2+成像、基因转导和免疫组化，它能够显示皮质和海马神经元之间的投射和突触的形成，能够在体外研究多个大脑区域之间的相互作用。类似地，Soscia等人开发了一个共培养海马和皮质神经元的平台（图2 B），用于研究不同的大脑区域如何建立连接、整合神经网络和增加它们的放电率。最近，Dauth等首次开发了包含三个脑区域的体外中枢神经系统模型，体外培养的大鼠前额叶皮层、海马和杏仁核来源的组织通过轴突实现连接（图2 C）。该模型充分证明在体外连接不同的大脑区域的重要性，与培养单类型细胞相比，共培养的细胞在细胞组成、蛋白质表达和电生理特性上均表现出很大的差异。该体外模型被用于模拟皮质边缘系统，并检查盐酸苯环利丁（PCP）对一个大脑区域的影响，并确定其他区域的反应。

图1、多个脑区的体外培养。（A）在芯片内生长的皮层（绿色）和纹状体（红色）神经元和对应的免疫荧光显微图。（B）新型多电极阵列，用于共培养原代海马和皮层神经元。（C）大脑芯片模型示意图，包括三个不同的大脑区域，前额叶皮层，海马体和杏仁核，微管蛋白III（绿色）和GFAP（红色）。（D）微流控装置的示意图，允许代谢耦合神经元和内皮细胞。

 

三、模拟血脑屏障

中枢神经系统模型不仅要模拟大脑复杂的神经元结构和功能，还需要考虑其独特的血管系统。中枢神经系统中血管内皮紧密连接，空洞极少，内皮细胞胞吞率非常低（Abbott et al., 2006）。大脑的血管系统包括一个高度特化的内皮细胞组成的血脑屏障，血脑屏障严密控制化合物进入大脑。因此，体外模型如果需要理解大脑对各种刺激的反应，就必须模拟由血脑屏障和血管周围系统组成的NVU与脑周细胞、星形胶质细胞和神经元密切相互作用。一般来说，确保一个给定的分子能够穿透血脑屏障，从而进入中枢神经系统是中枢神经系统药物开发中的一个主要挑战 （Herland et al., 2020）。在小分子药物开发中，计算药物分布和动物模型已经取得部分成功，但大分子生物药的快速发展，对大分子药物穿透血脑屏障模型的需求更大 （Gribkoff and Kaczmarek, 2017）.

已经开发出了几种体外模型来模拟NVU（总结见表2）。最近的一个模型将一个血脑屏障芯片连接到一个脑芯片，然后连接到第二个血脑屏障芯片，其中三个芯片中包含人类BMEC、神经元细胞、胶质细胞和周细胞（图2 D）。他们使用这个系统来分析组成NVU的单个细胞类型以及神经活性药物血管内给药的效果（Maoz et al., 2018）。

在体外建模时，要充分考虑到NVU和血脑屏障的特性。体内血脑屏障特性的评估是通过测量跨内皮电阻（TEER）、对小化合物的被动渗透性 （<1000 g/mol）以及外排和内流转运蛋白的活性 （Lippmann et al.，2012；Stebbins et al., 2016）。影响这些特性的一个关键因素是构建模型的细胞来源。原代人类BMEC保留了一些血脑屏障表型。但是，人类原代BMECs的TEER（通常不超过 200 Ω /cm2 （Mackic et al., 1999；Zenker et al., 2003）。这只有大鼠和青蛙体内TEER测量值的10% （Crone and Olesen, 1982；Butt et al., 1990）。2012年以后，随着hiPSC的出现，相关研究报道了hiPSCC衍生的BMEC样细胞的TEER值为>200Ω /cm2（Lippmann et al., 2012）。但是这些BMEC细胞的性质尚存在争论。

实时监测微流控芯片上NVU的主要指标得到了广泛的关注。研究人员已经在2D和3D细胞培养芯片中整合了二维渗透率和TEER测量 （Booth and Kim, 2012；Walter et al., 2016；Wang et al., 2017；Brown et al., 2015, Xu et al., 2016a；Partyka et al., 2017）。在体外构建NVU模型时，需要考虑一些重要因素：

1. 细胞与细胞间相互作用

共培养NVU细胞为体外模型增加了另一个层次的复杂性，使该模型能够更真实地重现体内条件。BMECs与中枢神经系统细胞共培养有助于重现内皮细胞的血脑屏障特性（通过强化紧密连接和极化转运体的表达） （Kasa et al., 1991；Megard et al., 2002；Didier et al., 2002, 2003；Haseloff et al., 2005；Lippmann et al., 2012；Herland et al., 2016；Hollmann et al., 2017）。此外，研究表明，星形胶质细胞和BMECs分泌的因子可以促进彼此成熟（Janzer and Raff, 1987；Fukushima et al., 2009；Blanchette and Daneman, 2015）.。

Transwell模型（表2）已广泛用于BMECs与中枢神经系统和非中枢神经系统细胞共培养；该模型允许无创TEER测量、渗透性分析和外排的评估 （Zenker et al., 2003；Colgan et al., 2008；Helms et al., 2014；Labus et al., 2014；Canfield et al., 2017；Delsing et al., 2018）。然而，这种方法反映的是单层非连续细胞的静态环境，因此不能完全重现体内血脑屏障的环境。

2. 血流

血液流动是开发NVU模型中应该考虑的一个重要参数。毛细血管中内皮细胞成熟与其受到的剪切应力密切相关。

Siddharthan等人的研究显示，BMECs中剪切应力与紧密连接蛋白ZO-1的上调存在相关性。2011年， Cucullo报道了剪切应力对BMECs转录组的影响；剪切应力会诱导紧密连接/粘附连接、耐药转运相关基因的表达 （Cucullo et al., 2011）。

器官芯片的出现使研究人员能够在体外观察血流刺激下血管和其他细胞的功能。HBooth和Kim首次使用含有脑内皮和星形细胞系的NVU微流控芯片模型，证明片上有血流灌注的NVU的TEER高于静态水平，NVU对示踪剂的渗透性也表现出类似体内的水平。更深入的研究表明，芯片上NVU比transwell模型表现出更低的渗透性（Prabhakarpandian et al., 2013；Walter et al., 2016；Partyka et al., 2017）。

3. 细胞外基质

在体外模拟ECM是一个巨大的挑战（Rauti et al., 2019）；ECM成分在整个大脑中都有所不同。不同的脑区具有独特的ECM组成，且脑血管ECM不同于脑ECM。脑血管系统中的BMEC在发育阶段的信号分子为纤维连接蛋白，成熟后改变为层粘连蛋白 （Herland et al., 2016；Adriani et al., 2017；Linville et al., 2019）。为了在体外再现NVU，应考虑脑血管系统和脑其他组织ECM的差异，以确保NVU在体外模型的准确性和有效性 （Rauti et al., 2019）。

大多数iPSC衍生的BMECs方案联合使用IV型胶原和纤维连接蛋白作为BMEC分化过程中的诱导因子 （Lippmann et al., 2012, 2014；Hollmann et al., 2017）。然而，其他类型的ECM成分也在体外的NVU中使用，如I型胶原蛋白。尽管I型胶原蛋白不存在于人类大脑中，但I型胶原蛋白的成胶特性使其在NVU的3D体外生成中非常有效 （Herland et al., 2016；Partykaet al., 2017；Wevers et al., 2018；Grifno et al., 2019；Linville et al., 2019）。ECM衍生的凝胶已被应用于微流控装置中，为现有的流体模型增加了另一层复杂性（Herland et al., 2016；Adriani et al., 2017；Linville et al., 2019）。

未完待续！

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本文由“FluidicLab流体实验室”原创出品，转载请注明出处。

​人类大脑极其复杂，因此开发任何中枢神经系统体外模型都是巨大的挑战。目前的动物模型缺乏许多基本的人类特征，传统的体外模型在模拟体内功能的能力也非常有限。这些模型的局限造成靶向中枢神经系统的药物开发成功率很低。过去的5年，中枢神经系统体外模型在复杂性和功能性方面都有了一个巨大的飞跃，新的模型有望克服传统模型的许多局限。hiPSC（人源诱导多能干细胞）技术的发展进一步提高了这些模型应用于转化医学的潜力。

但是，由于这些模型成本较高或成熟度较低，只有少数研究者采用了这些先进的体外平台。随着技术的发展，这些模型的制造成本已经大幅度降低，研究者也付出了巨大的努力来提高干细胞分化的质量。在此，我们将介绍2015年以来主要的中枢神经系统体外模型。我们特别关注细胞培养系统与微流控平台相结合的体外模型。我们将介绍这些系统的基本原理，回顾这些平台在健康和疾病研究中的成功实践。随后我们将总结这些模型在个性化医疗或大规模工业环境中应用所面临的挑战，并为正在考虑采用器官/类器官芯片技术的实验室提供了实用指南。

缩写：ALS=肌萎缩性侧索硬化症；BMEC=脑微血管内皮细胞；COVID-19=新型冠状病毒肺；ECM=细胞外基质；GBM=多形胶质母细胞瘤；hiPSC=人源诱导多能干细胞；NVU=神经血管单位；PDMS=聚二甲基硅氧烷；SARS-CoV-2=严重急性呼吸综合症冠状病毒2；TBI=创伤性脑损伤；TEER=跨内皮电阻

本文包括以下章节：

一． 中枢神经系统体外模型概述

二． 使用hiPSC构建中枢神经系统体外模型：优势和挑战

三． 类器官/器官芯片中枢神经系统体外模型介绍

四． 基于类器官/器官芯片的中枢神经系统疾病模型

五． 商品化的类器官和器官芯片系统使用指南

简介

人类大脑的复杂性远超其它动物。人类大脑体积大、皮层折叠程度高，人类神经疾病往往拥有独特的生理病理特征。不幸的是，目前应用于转化医学的中枢神经系统模型存在诸多缺陷：动物模型缺乏许多基本人类特征，价格昂贵，通量低，而且往往存在伦理问题；传统的体外模型不能提供行为反应、功能反应或系统反应（器官-器官相互作用）的信息，对许多实际应用来说显得过于简单。

缺乏合格的中枢神经系统体外模型是中枢神经系统药物开发成功率低的一个重要原因（Kesselheim et al., 2015; Gribkoff and Kaczmarek, 2017)；较低的药物开发成功率又导致许多大型制药公司缩减了它们在神经系统领域的研发投入（Wegener and Rujescu, 2013）。

为了更好的模拟健康和病理条件下中枢神经系统的生理特征和功能，许多学术和产业研究人员开始使用iPSCs (Shi et al., 2017），器官/类器官芯片（Pasca, 2018），水凝胶3D打印（Hopkins et al., 2015）等技术来建立新的体外模型。虽然这些方法仍无法完全复现人类大脑复杂的生理学、解剖学特征和功能，但他们在模拟体内功能和发病机理，揭示现有体外模型无法发现的生理互作方面展示了光明前景。

为了让读者快速了解不同的中枢神经系统模型，我们比较了啮齿动物模型、传统细胞培养、类器官和器官芯片模型，对每个模型在中枢神经系统研究的可用性进行了评级（表1）。先进的体外模型在成本、易用性、可获得性等方面正变得平易近人。这些模型有助于补充传统的体外和体内模型，从而提高临床前评估的总体准确性。

在随后的综述中，我们将主要覆盖以下方面：

1、中枢神经系统体外模型的一些主要进展。

2、考虑到先进的体外平台的一个关键目标是提高实验结果的可转化性，我们重点讨论了将hiPSCs整合到这些平台的一些挑战。

3、详细解释了中枢神经系统体外模型的一些基本原理，并讨论了这些模型的一些成功实践。

4、中枢神经系统疾病模型。

5、为考虑采用这些技术的生物医学实验室提供了实用的指南。

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章节一、中枢神经系统体外模型概述

一个合格的中枢神经系统体外模型必须满足两个条件：

1. 包含所有的功能细胞类型。中枢神经系统是一个复杂的细胞网络，由神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、周细胞、免疫细胞和血管内皮细胞组成，并生长在组织特异性的细胞外微环境中 （Rauti  et al., 2019）。了解中枢神经系统的机理对于识别潜在的药物靶点，预测药物副作用，了解神经系统疾病的发病机制至关重要。

2. 充分模拟细胞外环境。除了包含不同的细胞亚型，合格的中枢神经系统体外模型还必须重现细胞外环境，包括特殊的细胞组织形式和细胞间的相互联系。因此，在构建模型时，必须尽可能重新细胞外基质(ECM)的物理、化学和机械特性（Frantz et al., 2010; Abdeen et al., 2016; Uwamori et al., 2017)。

大脑ECM由三个基本的结构组成：基底膜、神经周网和间质基质（Novak and Kaye, 2000; Yamaguchi, 2000; Bonneh-Barkay and Wiley, 2009;  Lau et al., 2013;  Rauti et al., 2019)。基底膜主要由IV型胶原、层粘连蛋白-核原复合物、纤维连接蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖（perlecan和agrin）和大量的生长因子组成（Baeten and Akassoglou, 2011；Xu et al., 2019；Barcelona and Saragovi, 2015)。神经元周网主要由透明质酸、蛋白聚糖组成。间质基质则由蛋白多糖、透明质酸、肌腱蛋白和纤维蛋白组成 (Novak and Kaye, 2000；Rauti et al., 2019)。大脑ECM外环境是细胞迁移的物理支持，也传递影响细胞生长和分化的机械和生化刺激 (Garcı´a-Parra et al., 2013；Levy et al., 2014；Potjewyd et al., 2018；Rauti et al., 2019)。

目前广泛使用的中枢神经系统体外模型包括二维和三维细胞培养模型 (Zhuang et al., 2018)。原代细胞或组织培养模型保留了大多数细胞原位特征，比较如实地反映细胞形态和功能信息（Balgude et al., 2001；Hopkins et al., 2013)。但是，它们仍存在长期保存后活性降低，传代能力的缺陷以及细胞成熟后多样性的问题( (Walsh et al., 2005；Gahwiler, 1981)。另外这些模型通常是动物来源的，因此缺乏人类大脑的复杂环路和结构（Herculano-Houzel, 2014; DeFelipe, 2015；Hopkins et al., 2015)。

人类来源的干细胞和hiPSCs为开发可规模化复制的人类中枢神经系统模型创造了机会 (Dubois-Dauphin et al., 2010；Hopkins et al., 2015；Pacitti et al., 2019；Silva and Haggarty, 2020)。此外，3D体外培养系统(图1 C)可以再现复杂的细胞间相互作用，更加逼真的重现体内细胞微环境。新的3D中枢神经系统模型，如神经球和类器官（Hogberg et al., 2013），主要以干细胞技术为基础开发。神经球(图1 D)是自组装的致密结构，主要由神经干细胞、神经元和胶质限制性祖细胞、有丝分裂后的神经元细胞和死亡（濒亡）的细胞组成。神经球是研究神经发生和神经发育的有价值的系统，也是一个近乎无限的神经元和祖细胞的来源。神经球的一个主要问题是：由于对氧气和营养物质的获取能力有限，生长在神经球中心的细胞会死亡 (Bez et al., 2003；Jensen and Parmar, 2006)。其它缺点包括：神经细胞经过几轮传代后会丧失干细胞潜能，不同实验室之间培养的神经球实验结果重复性较差。

Lancaster and Knoblich (2014)首次引入了人类大脑类器官的概念(图1 E)。人类大脑类器官是一种来源于多能干细胞的自组装细胞群，具有早期胚胎中枢神经系统的谱系和结构。大脑类器官的使用已经呈指数级增长（Lancaster et al., 2013；Mariani et al., 2015；Jo et al., 2016；Raja et al., 2016；Lee et al., 2017)。鉴于类器官可使用基因组编辑技术，因此它对识别和测试新的治疗方法特别有用 (Yin et al., 2016；Gonzalez-Cordero et al., 2018；Pellegrini et al. 2020)。最近发表了一些体外类器官模型，展示了人类脉络膜丛的关键功能，屏障形成和脑脊液分泌，均展示了类器官模型的巨大潜力。类器官的缺点包括：它们自发形成的特性使得类器官在细胞类型和组织方面的可重复性较差。类器官也缺乏许多对器官生理功能至关重要特征，如血管灌注、机械刺激和循环免疫细胞的存在等（Ingber，2016)。

结合当前体外和体内模型的优势【表1】，科研工作者开发了器官芯片平台。在器官芯片中，细胞和组织在微腔室中培养，整体的微环境也可以得到很好的控制（Meyvantsson and Beebe, 2008；Meer and Berg, 2012；Halldorsson et al., 2015；MacKerron et al., 2017；Osaki et al., 2018；Sosa-Herna´ndez et al., 2018；Oddo et al., 2019)。最简单的器官芯片平台是一个单一的、可灌流的微腔，在其中可以生长一种细胞或多种细胞混合物。在更复杂的设计中，同一芯片中的两个或多个腔室被膜、通道或凝胶分开，以培养不同的细胞类型，各腔室的细胞直接接触或通过分泌物来传递细胞间的相互作用(图 1F和图 2)。在更高的层次上，通过连接两个或两个以上的器官芯片(图 1F)，即可模拟不同的组织或区域的相互作用，实现更加复杂的功能(如血脑屏障) (Bhatia and Ingber, 2014；Phan et al., 2017；Oddo et al., 2019)。这些多芯片系统让研究多器官生理系统成为可能(Esch et al., 2014；Maschmeyer et al., 2015；Ingber, 2016)。

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器官芯片有几个关键的优势：

1. 器官芯片设计灵活，制造成本低。

2. 与传统的细胞培养形式相比，污染风险低，试剂消耗少，实验通量高（Halldorsson et al., 2015)。

3. 血液流动和剪切应力可以得以模拟 (Bhatia and Ingber, 2014；Bischel et al., 2015；Benam et al., 2016；Ingber, 2016)。‍

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【图2】：中枢神经系统体外模型。（A）共聚焦显微图显示2维培养的海马细胞，β-微管蛋白III（红色），胶质蛋白GFAP（绿色）和神经元（蓝色）。比例尺=100 μm。（B）海马切片的显微图片。（C）经共聚焦成像并3D重构后，120 μm厚的水凝胶包裹的皮质神经元网络，β-微管蛋白III(红色）、胶质细胞(绿色)、细胞核(蓝色)。比例尺=50mm。（D）神经球共聚焦成像结果，对Arl13b（红色）和DNA染色。（E）神经元(TUJ1，绿色)和祖细胞(SOX2，红色)的类器官免疫染色。（F）一个微流控芯片的示意图，其中血管和神经元网络在一起培养。（G） 体内和3D打印体外脑皮层结构示意图，其中每种颜色代表不同的切片。在底部的切片中，使用共聚焦显微镜重建培养5天后的神经元。比例尺=100 μm 。（H） 一种的3d打印程序示意图

然而，也有一些障碍限制了器官芯片的使用，这些障碍包括相当长的原型设计时间，缺乏标准化的实验步骤，需要专门的设备和复杂耗时的制造过程 (Coluccio et al., 2019)。

为了克服这些问题，研究人员一直在开发基于3D打印的(【图2】  G和H )的体外脑模型 (Lozano et al., 2015；Han and Hsu, 2017；Hampson et al., 2018；Sivandzade and Cucullo, 2018)。3D打印可以使用不同的材料（包括活细胞）沿着中枢神经系统的z轴来制作具有生物活性的3D结构，从而构建中枢神经系统体外模型 (Xu et al.，2006;  Gu et al., 2016, 2018；Bishop et al., 2017；Han and Hsu, 2017；Thomas and Willerth, 2017；Knowlton et al., 2018；Potjewyd et al., 2018；Oliveira et al., 2019)。3D打印的体外模型可定制设计，精确制造更可靠的体内神经组织，以保证在临床研究和药物筛选过程中的一致性。但是，在3D打印中，需要开发出对细胞刺激最小的3D打印方法、保证模型可重复性、更好地复现体内神经组织中的分子梯度，设计细胞外基质、并对模型进行充分的验证 (Rauti et al., 2019)。

目前大多数器官芯片都相对较薄（100-1000 微米高，在这些结构中的细胞层更薄）。因此，与传统的3D培养不同，这些器官芯片通常与实时成像设备兼容，可用来做细胞迁移分析和传统的免疫组化评估。例如，Deosarkar 等使用共聚焦显微镜对器官芯片中的独立血管通道进行成像，成像尺寸为200*100*2762微米（Deosarkar et al,, 2015)。双光子显微镜最新技术发展，人工智能和机器学习辅助的先进3D成像技术 (Joshi et al., 2018；Masullo et al., 2018；Puls et al., 2018; Scheeder et al., 2018；Booij et al., 2019)和生物传感器的集成（Misun et al., 2016；Maoz et al., 2017)，hiPSC衍生的细胞援建有望推动3D体外建模的进展。最近评估表明，生物传感器、微流控技术和组织培养的结合可能很快就会大幅度减少基于动物模型的研究（Dove et al., 2018)。

除了基于细胞的体外平台的外，基于纯理化和计算的体外模型的发展也很重要，部分可以作为基于细胞的模型的替代品。这类模型包括固定化人工膜测量(IAM)、平行人工膜渗透性测量(PAMPA)和固体支持磷脂膜测量(TRANSIL)（Vastag and Keseru, 2009；Sharma et al., 2019)。基于计算模型和模拟，如机器学习和深度学习方法也正在变得越来越复杂（Yuan et al., 2018)，可以用来补充甚至替代一些生物学实验。基于计算的模型提供了合成、预筛选和虚拟测试新药物的可能性，降低了实验室实验和昂贵的临床试验的需要，加速了药物开发过程 (Naik and Cucullo, 2012；Alsarrani and Kaplita, 2019；Chlebek et al., 2019)。然而，这些基于非细胞的模型验证还不够充分，通过这类研究获得的结果必须通过体外和体内研究来验证 (Naik and Cucullo, 2012)。

事实上，确保一个模型忠实地再现了体内的生理、病理过程，对于任何模型在转化医学中应用都是必不可少的。由于中枢神经系统生物学上的复杂性，验证体外中枢神经系统模型格外具有挑战性。因此，需要巨大的努力来确定中枢神经系统体外模型能在多大程度上代表体内的反应。例如，Belle等最近使用电生理方法来对比体内和体外培养的皮层神经元之间的差异。对于任何模型来说，体外到体内的比较都至关重要 (Frazier, 1990；Belle et al., 2018；Jones et al., 2018)。

另一个阻碍中枢神经系统体外模型应用于转化医学的障碍与它们所使用的细胞有关。例如，虽然器官芯片的主要目的是模拟人体内的微系统，但本文中引用的许多器官芯片研究都使用动物细胞，而不是来自hiPSC的细胞（表1）。尽管我们相信基于hiPSC的器官芯片有很大的希望应用于未来的精准医疗，但即使是基于hiPSC的系统也不可能完全预测体内的结果（Doss and Sachinidis, 2019；Ortuno-Costela et al., 2019）。由于科学家们在体外体系中使用hiPSCs仍然面临的巨大困难，因此目前的体外模型还依赖于非hiPSC来源的细胞，大大限制了其在转化医学中的指导作用。

未完待续，敬请关注！

     

             分散于 PBS buffer中的微球                                                 微球粒径统计

 

1. 试剂

• 微滴生成油 (含2% 表面活性剂的HFE-7500 (wt%), FluidicLab)
• EDTA (0.5 M, pH 7.4 Macklin, E885215-1L)
• NaOH (Macklin, S817971-500 G)
• CaCl₂  (无水, 99.99%, Macklin, C805228-100 G)
• 海藻酸钠 (黏度 200 mpa.s，FludicLab)
• 乙酸 (99.8%, Macklin, A801296-500 ML)
• 1H,1H,2H,2H-全氟己-1-醇 (PFO, 98%, Macklin, H817022-25 G)
• HFE-7500 (3M Novec^TM)
• n-Hexane (正己烷, HPLC, H810749-1L)
• Span^TM 80 (Aladdin, S110839-250 ML)
• 娃哈哈纯净水

2. 硬件设备

• 两通道压力控制器(FluidicLab PC-1)
• 100 μm剪切口疏水的微流控玻璃芯片(液滴) （FluidicLab）
• 配套微流控玻璃芯片夹具（FluidicLab）
• PTFE 管(0.6/1.6 mm)若干
• 配有高速相机的普通光学显微镜及配套软件
• 两个流量传感器 （规格: 80 μL/min） (FluidicLab )
• 两个储液池 (规格: 15 mL和50 mL)
• 水平旋转仪 (泰州诺米医疗科技, NMY-100)
• 万分位电子分析天平
• 梅特勒pH计
• 高速离心机 (湖南湘仪H18500R)
• 100 μm细胞滤网
• 20 mL透明玻璃瓶
• 玻璃培养皿 (直径100 mm)

3. 溶液配制

(1). 4 M NaOH 

取8.0 g NaOH置于50 mL Falcon离心管中，用娃哈哈水溶解并定容至50 mL。

(2). 5 M CaCl₂

 取11.1 g CaCl₂  置于50 mL Falcon离心管中，用娃哈哈水溶解并定容至20 mL。

(3). 2 %海藻酸钠水溶液 (wt%)

取0.2 g 海藻酸钠置于15 mL Falcon离心管中，加入娃哈哈纯净水至10 g。

注意：溶解海藻酸钠时用时较久，要不断的超声并涡旋振荡，最后静置将个别碎沫慢慢溶解 (以上仅为个人建议，不同厂家溶解效果也不一样，能否做出也未可知)。

(4). 400 mM Ca-EDTA

取400 μL 的5 M CaCl₂ ，4 mL EDTA (0.5M, pH7.4)加入20 mL 透明玻璃瓶中并振荡均匀，然后用 4 M NaOH调整pH至7.2，最后加入娃哈哈纯净水定容至5 mL。

注意: 调pH加NaOH溶液时，需少量多次。初始pH为3.65左右，待加至pH为5.6以上时需尽可能减少NaOH溶液加入的量，适当可用移液枪取1 μL 或更少的量加入。

(5). 1% 海藻酸钠 (wt%)- 200 mM Ca-EDTA 

将2 % 海藻酸钠水溶液和400 mM Ca-EDTA等体积混合，使用0.22 μm PTFE微孔膜过滤。

(6). 20% PFO/HFE-7500 (v/v)

取5 mL PFO 置于50 mL Falcon离心管中，用HFE-7500定容至25 mL，振荡均匀。

(7). 1% Span 80 in Hexane (v/v)

取0.3 mL Span 80加入Hexane定容至30 mL，振荡均匀.

(8). 2 % 乙酸/微滴生成油 (v/v)

取200 μL 的乙酸加入 15 mL Falcon离心管中，用微滴生成油定容至10 mL，振荡均匀。

4. 实验操作

1. 按照“压力控制器使用手册”连接设备、储液池和两路流量传感器；
2. 将微滴生成油和1% 海藻酸钠-200 mM Ca-EDTA水相分别加入至50和15 mL的储液池中;
3. 用软件控制分别给两个通道一定的压力以排出管路中的空气，待有液体流出时再分别关掉压力;
4. 分别将油相和水相管插入经疏水处理的玻璃芯片对应的油相和水相入口，然后取一段30 cm PTFE管插入玻璃芯片出口；
5. 用软件控制并设置流速，比如油相流速为70 μL /min，水相流速为7 μL /min;
6. 待微球稳定生成后，将装有10 mL 2%乙酸微的滴生成油的玻璃培养皿放置于管路出口开始收集，且收集过程中需要用水平旋转仪振荡;       注意：水平旋转仪振荡速度50 rpm/min以下，且保证收集的微球一直能滴入培养皿中；收集时可以用保鲜膜盖在收集管上尽量减少乙酸的挥发。
7. 收集完毕后可以适当补充乙酸以保证其浓度基本维持不变，然后振荡固化12 h；
8. 待固化完全后， 5000 rpm, 3min离心处理；
9. 用移液枪取出底部油相，然后按2:1 (v_PFO:v_微球)加入20% PFO的HFE-7500，5000 rpm, 3min离心处理至少两次;
10. 用移液枪取出底部溶液，然后按2:1 (v_n-Hexane:v_微球)加入1% Span 80的n-Hexane，5000 rpm, 3min离心处理至少两次；
11. 用移液枪取出上部溶液，加入一定体积PBS 5000 rpm, 5min离心处理，最终分散于PBS中;
12. 固化后的微球可以用100 μm细胞过滤器过滤。

5. 注意事项​

1. 有关海藻酸钠：不同厂家效果可能会不太一样，也就是不能确保能否实现完全固化；海藻酸钠黏度太大不利于剪切，所以建议黏度在300 mpa.s以下。
2. 配Ca-EDTA混合液时，调节pH很重要，若pH过低则水相会直接固化；若太高则会中和油相中的酸反而不利于微球固化。
3. 本实验操作中钙离子浓度是很高的，若担心影响包裹的细胞或材料则可以尝试降低钙离子浓度。
4. 本实验中接收液乙酸浓度也比较高，也可以尝试降低，但固化时间会有所延长。
5. 接收时，要保持培养皿不断振荡以促使微球加快固化，采用FluidicLab的海藻酸钠材料时，固化后微球会团聚在一起浮在油相表面。后续可通过超声振荡促使其分开。

 

患者来源类器官已成为一种有效的体外癌症研究模型。与2D细胞系、3D细胞系和原代细胞培养相比，患者来源类器官已被应用于药物筛选，以证明基因突变与靶向治疗敏感性之间的相关性。类器官也被用于联合临床试验，以比较类器官的药物反应与相应患者的临床反应。许多研究已经成功地使用类器官来预测癌症患者的治疗反应。利用微流控技术大规模的培养患者来源的类器官，显示了在高通量药物筛选和促进临床治疗决策方面的巨大前景。

四种体外肿瘤细胞培养模型的比较。

二维细胞系：从ATCC中获得细胞后，可在10cm的培养皿中培养。

3D细胞系：从ATCC中获得细胞后，可以在低黏附96孔板中生长。

2D原代细胞：从膀胱癌肿瘤中获得原代细胞后，这些细胞可以在10厘米的培养皿中生长。经过几代后，它们失去了异质性。

类器官：从膀胱癌肿瘤中获得原代细胞后，这些细胞可以在metrigel微滴中生长为类器官。

现有的体外肿瘤模型：

二维细胞系

细胞系来源于获得致癌突变的细胞，他们主要在二维平面上生长。虽然二维细胞系已经在药物筛选上得到广泛的应用。但是，这些模型仍然有很大的局限：

1、无法模拟细胞生长的微环境，无法真实的反映细胞异质性，相邻细胞间、细胞与胞外基质复杂相互作用无法得到真实呈现。

2、虽然许多癌细胞系携带在相应癌症中发现的重要基因突变，但并不一定包含这些癌症所有的基因突变。例如，7种已建立的前列腺癌细胞系均不携带在患者中发现的SPOP突变和FOXA1突变。

3、肿瘤细胞系的基因组成在传代和不同的实验室条件下会发生显著变化。例如，之前对27株MCF7细胞系进行抗癌化合物检测时，发现他们对药物反应非常不同。

3D细胞系 

替代2D细胞系的一种方法是将细胞系三维培养形成球状体。与2D培养相比，3D细胞培养明显的改善了细胞形态、力学性能、分化和活力。细胞在3D培养中的药物代谢和分泌行为也使3D细胞团更适合药物筛选。 

虽然3D细胞培养克服了2D细胞培养中微环境的问题，但是2D细胞培养中的一些根本问题，如细胞异质性无法呈现、细胞系在传代过程中呈现出的多样性等问题均无法得到解决。

原代细胞培养

原代细胞培养提供了一种更个性化的细胞培养方式。它允许科学家使用与个体患者相同的细胞，而不是使用来源于一个患者样本的细胞来代表患有该特定疾病的所有患者。培养原代细胞包括从新鲜的病人组织中获取细胞并进行体外增殖，但是培养原代细胞仍存在许多困难。

1、许多细胞在培养后不久就停止生长。

2、在多次传代后，分裂速度快慢不同的细胞发生了明显的基因表达分化。

3、多次传代后，细胞种群的比例发生了明显的变化。

患者来源的类器官(PDOs)

PDOs拥有3D细胞系、原代细胞系的优点，又克服了各自的局限，是目前最有前景的细胞培养技术。

简单地说，培养PDOs首先将病人组织粉碎，并将回收的细胞置入基质胶或ECM中，体外培养使PDOs持续生长，最终生长为被称为“类器官”的球体。生长良好的类器官保留了原始肿瘤的遗传图谱和组织学特性。PDOs具有巨大的优势：

 1. 肿瘤类器官可以从常规癌症活检获得的组织培养，成功率高，使其可以探索肿瘤发生不同阶段的变化。

 2. 基因表达谱在PDOs中往往保持更稳定。

 3. PDOs具有高度的可重复性。研究表明在大多数情况下，PDOs表现了对特定药物的同质反应。 

4. 肿瘤类器官也可以冷冻保存、扩增、基因分析和迅速进行药物处理。

PDOs用于指导临床治疗

在癌症治疗中，都会在手术切除肿瘤前后都使用药物进行辅助治疗。这些药物主要用于化疗、靶向治疗、放疗，以及近年来的免疫治疗。不同患者有不同的基因背景和体内环境，这可能会影响他们对某些药物的反应。因此，需要一个个性化的模型系统中测试这些药物。 

通过研究PDOs和患者对相同药物反应的的相关性，可以检测PDOs在治疗方案选择中的有效性。 

临床通过比较胃食管癌患者和来源于患者的类器官对紫杉醇的耐药性，证明了两者之间具有高度的相关性。另一项关于12名患者和患者来源类器官的研究显示，患者对tamoxifen的体内反应与乳腺癌类器官体外反应呈正相关。

 2019年的一个临床病例也显示了PDOs在指导肿瘤化疗方案中的有效性。一个结直肠癌转移患者最初接受了联合药物化疗方案，包括药物5-FU、leucovorin和奥沙利铂。不幸的是，化疗完成4个月后肿瘤继续进展。为了决定是否坚持该治疗方案，首先用肝转移活检组织培养出类器官，然后使用药物来处理，并分析了类器官直径和氧化还原比，结果支持继续使用该化疗方案。后续的治疗效果也证明该化疗方案确实减少了肝转移肿瘤的体积。 

另外一项临床研究表明，患者和PDOs对放疗的敏感性高度相关，在一个80个病患样本的研究中，68个PDOs显示了和患者相同的反应。

微流控高通量患者来源类器官(PDO)培养方案

本文介绍的方法主要参考以下文献：

* “Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids”

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在微液滴中包裹单细胞和带有条码序列的水凝胶微球是高通量单细胞测序的基础。通过在微液滴中完成条码引物的释放、细胞裂解和扩增等操作，我么可以对单细胞的转录组、表观遗传组等组学信息进行高通量和深度的覆盖，又兼顾了单细胞的分辨率。单细胞组学技术是生物、医学最有潜力的技术之一。

目前单细胞包裹系统的推广受制于以下几个问题：

1. 微流控包裹系统昂贵的价格。2. barcode水凝胶微球合成困难。3. 微流控芯片和试剂价格昂贵。

FluidicLab定制化的单细胞包裹平台，专为科研用户推出。Fluidiclab提供极高性价比的的微流控芯片单细胞制备系统、可控降解barcode水凝胶微球、PFPE-PEG微滴生成油，使得科研工作者可以在5分钟内就开始自己的单细胞包裹实验。

正在进行中的单细胞包裹实验，左侧蓝色为细胞悬液，右侧为可降解的barcode聚丙烯酰胺微球，粒径约为70微米。

包裹完成的微滴，98%以上的微滴中只有一个水凝胶微球，大于60%的细胞均被包裹在微滴中。

由于气体的可压缩性，使得微气泡在超声成像造影和药物输送方面有着广泛的用途，越来越受到各行业的关注。微气泡作为超声造影最初是为了改善超声信号，增加组织边界和特征的描绘。它是基于气体的可压缩性使得微气泡比周围的血液和组织更有效地散射超声能量，从而使其成为血管成像的有效探针。早在1968年，Gramiak等通过研究发现在心导管注射生理盐水时，随着注射所产生的微气泡使得在主动脉中观察到造影现象。尽管在二十年前，微气泡作为药物输送的载体在临床应用上还很概念化，但目前正在进行的一些研究已经取得了明显的进展，如作为基因的载体用于基因治疗、作为给药载体将药物送到指定区域等，这表明在不久的将来微气泡很有可能应用于临床。

理想的微气泡具有高稳定性和高单分散性。前者主要取决于其外壳成分，外壳中含有高浓度的表面活性剂，可以在微气泡表面形成类似固化的粘结剂，以此减缓气泡与气泡间的融合。然而，后者实现高单分散的微气泡仍是一个挑战。当前主要采用超声或机械搅拌方法产生微气泡，这类方法虽具有简单、方便和成本低等优势，但是产生的微气泡大小均一性差。由于超声成像造影和药物输送受共振频率影响，而共振频率范围的选择又取决于直径大小，所以生成粒径均匀的微气泡很有必要。

为了提高微气泡的均匀性，其他各种方法也被相继报道。其中基于微流控方法制备出平均直径 <10 μm的单分散气泡悬浮液是最有力的方法之一。因此，在这里我们通过FluidicLab微气泡平台提供的微气泡生成芯片和对应夹具，用户只要简单的连接管路，三分钟内即可完成微气泡的生成。

双乳液滴是化妆品、制药或食品工业非常有前途的材料。双重乳滴可用于封装比较敏感的化合物（药物、维生素、香料……），保护活性物质，并最终根据需要在合适的时间和地点释放封装的化合物。

双乳液滴的获得非常复杂。借助微流体技术可以高效稳定的生成双乳微滴。目前常用的生成微滴的结构为以下三种：co-flow，T-junction，flow focus。这三种结构均可用于双乳液液滴的形成。生成双乳液滴最简单的几何形状是连续的两个流动聚焦结构。在第一个流动聚焦处形成的液滴在第二个流动聚焦处被封装到外部液滴中。

通常，双乳液是用含两种性质不同的表面活性剂的分散相分两步制备的。例如，要形成水包油包水乳液，首先将水用含有疏水性表面活性剂的油相乳化，然后在第二步中用含有亲水性表面活性剂的水相重新乳化。

使用玻璃毛细管可有效产生双乳液液滴，但组装起来比较困难，重复性较差。比较稳定可靠的方法是使用局部改性的微流控芯片来进行。

FluidicLab双乳化微滴平台提供已经进行局部改性的双乳化微滴生成芯片和对应夹具，用户只要简单的连接管路，五分钟内即可完成双乳微滴的生成。