诱导多能干细胞由终末分化的体细胞经诱导产生,其功能类似于胚胎干细胞,使用人源诱导多能干细胞可以避免干细胞使用上的伦理问题,因此在转化医学中得到广泛的应用 (Yu et al., 200;Loh et al., 2009;Polo et al., 2010;Halevy and Urbach, 2014;King and Perrin, 2014;Choi et al., 2015;Shi et al., 2017;Volarevic et al., 2018)。
来源于健康人和患者的体细胞可被重编程为干细胞,这些干细胞可再分化为特定细胞类型,移植到患者体内(Sa´nchez Alvarado and Yamanaka, 2014)。然而,将hiPSC应用到中枢神经系统治疗中仍面临巨大的挑战(Braganc¸a et al., 2019;Ortuno-Costela et al., 2019)。这些挑战一方面由于脑组织结构上的复杂性,另外一方面是因为免疫反应(即使是在自体来源的情况下),往往导致中枢神经系统移植失败(Zhao et al., 2011;Nikolakopoulou et al., 2016;Garreta et al., 2018)。这些体内尝试的结果充分证明了建立有效的个性化中枢神经系统体外模型的必要性。
来自正常和病患的hiPSC已被用于模拟人类脑组织,以阐明其在正常和病理环境中的功能和机制。hiPSC与器官芯片结合,使研究人员能够复现人类中枢神经系统的复杂结构,如血脑屏障 (Vatine et al., 2019)。基于hiPSC的脑芯片设备通常被用于研究神经发育和神经退行性病变,为再生医学、毒理学和高通量研究进展做出了重大贡献 (Berg et al., 2019)。但是,在研究人员试图将hiPSC细胞整合到体外平台中时,仍然面临着多种障碍。
目前构建基于hiPSC的先进体外模型面临的挑战:
1. 供体多样性和细胞异质性
供体多样性是原代细胞共有的特征,是构建hiPSC体外模型中的主要障碍。在重编程和分化过程中残余的表观遗传记忆、特殊的遗传背景导致了hiPSC衍生细胞系之间的巨大多样性 (Kim et al., 2010, 2011;Polo et al., 2010;Bar-Nur et al., 2011;Boland et al., 2014)。由于不完全的重编程,一些hiPSC细胞系显示出增殖和分化潜能的缺陷 (Ohnuki et al., 2014)。
2. 分化步骤、重复性和细胞成熟度
可靠的模型需要高质量的hiPSCs和有效的分化方案,以达到预期的细胞命运。因此,学术界和工业界的研究人员一直致力于开发中枢神经系统谱系特异性分化步骤。然而,对纯细胞和成熟细胞类型的需求在很大程度上仍未得到满足。这些细胞经常表现出不成熟的、具有胚胎组织属性的特征。这些细胞可以作为神经发育和早发性疾病研究的良好模型,但不能充分模拟晚发性疾病和成熟组织 (Miller et al., 2013)。一些研究已经报道了由于残留的表观遗传记忆,hiPSCs偏向于分化为特定谱系的细胞。通过增加分化前的传代数,可以将这些细胞重置为多潜能模式 (Polo et al., 2010;Bar-Nur et al., 2011;Kim et al., 2011;Boland et al., 2014;Kedziora and Purvis, 2017;Doss and Sachinidis, 2019)。总的来说,为了提高基于iPSC的体外模型的可转化性,生产高质量的hiPSCs仍然是一个关键问题。
3. hiPSC来源细胞的免疫原性
早期在动物身上进行的研究 (de Almeida et al.,2014;Zhao et al., 2015)表明,分化细胞的免疫原性低于相应的iPSC群体。因为hiPSC可以规避生理免疫反应,避免患者的排斥反应,hiPSC来源的组织可以取代自体组织移植。然而,也有证据表明,hiPSC衍生的体外模型可能缺乏预测免疫反应方面的能力。在这种情况下,hiPSC衍生的模型无法很好地模拟脑组织中免疫介导的疾病,从而阻碍了药物的成功开发。
4. 使用基于hiPSC构建神经退行性疾病模型
使用hiPSCs对单基因疾病建模较为准确,但对于复杂的,多基因疾病和散发性疾病建模仍较困难。迄今为止,对于复杂的多基因疾病的研究方法是将患者和来自同一家族的健康成员进行比较;病变通常归因于同一家族中健康和病人比较后得到的突变,从而找到疾病原因。这种方法可以防止研究人员将疾病相关的变异与由其他因素引起的变异混淆起来。由于大多数神经退行性疾病都是散发性的,有必要使用大量患者来源的hiPSC来降低研究的信噪比,提高结果的准确性(Doss and Sachinidis, 2019)。此外,hiPSC衍生的细胞通常被用于2D培养,因此缺乏三维空间的相互作用;工程化的3D培养模型提供了类似于体内的环境,以方便研究遗传和环境线索如何影响疾病(Sharma et al., 2020)。
5. hiPSC来源细胞的区域特性
人类中枢神经系统的复杂性来自于多个神经细胞亚型之间的相互作用。而大多数神经系统疾病源于特定细胞亚型的缺陷,其潜在机制在很大程度上仍难以确定 (Imaizumi et al., 2015)。因此,准确的疾病建模需要使用具有特定区域特性的分化细胞。事实上,世界各地的研究人员已经使用来自患者的hiPSCs来研究几种神经系统疾病,包括肌萎缩性侧索硬化症(ALS)、阿茨海默病、精神分裂症和帕金森病 (Cooper et al., 2010;Zhang et al., 2014;Ahmad et al., 2018;Fujimori et al., 2018;Henstridge and SpiresJones, 2018;Li et al., 2018;Mishima et al., 2018, Osaki et al., 2018c;Ishii et al., 2019;Penney et al., 2020)。在这些研究中,hiPSCs被分化为不同的细胞类型,从而提供了具有区域特征的细胞疾病模型。然而,由于目前的分化方案在高纯度培养各种神经元亚型方面的能力有限,在这些研究中获得的结论仍有很大的不确定性。
将神经元胞体体与延伸的神经突进行物理分隔的概念首先由 Campenot提出 (Campenot, 1977)。2003年,Taylor等首次利用微流控技术,在细胞培养室中加入微凹槽;研究人员从而将神经元胞体和神经突触物理分开,并使用该系统来研究神经突触的局部损伤 (Taylor et al., 2003;Neto et al., 2016)。2005年Taylor率先开发了一种基于微流体的体外平台来研究损伤后的轴突再生 (Taylor et al., 2005)。Park进一步改进了该设备,以研究神经元-胶质细胞之间的相互作用和轴突髓鞘形成 (Taylor et al., 2005;Park et al., 2006, 2009a, 2012;Higashimori and Yang, 2012;Shi et al., 2013)。为了阐明髓鞘形成机制,科学家在同一系统内共培养神经元和神经胶质细胞,并应用于脱髓鞘疾病(多发性硬化症)的治疗策略研究 (Park et al., 2009b;Yang et al., 2012;Shi et al., 2013)。后续开发的系统将免疫细胞、hiPSC来源的小胶质细胞、hiPSC来源的少突胶质细胞也整合进来,旨在揭示人类脱髓鞘脑组织中发生的复杂细胞过程 (Abud et al., 2017;Douvaras et al., 2017;Haenseler et al., 2017;Pandya et al., 2017;Garcia-Reitboeck et al., 2018;McQuade et al., 2018)。
在多芯片设计中,几个器官芯片连接在一起,模拟神经组织复杂的细胞结构。例如,在人类神经血管单元(NVU)的模型中,通过将三个芯片联通在一起,揭示了内皮细胞和神经元细胞之间的代谢耦合(Maoz et al., 2018)。
微流体技术也被广泛用于探索生化因子如何影响轴突生长、寻径和突触功能(Wu et al., 2005;Cox et al., 2008;Taylor et al., 2009;Gumy et al., 2011;Park et al., 2014;Kung et al., 2015;Deglincerti et al. (2015)。Deglincerti利用轴突与神经元体细胞的物理分离,表明生长锥与局部蛋白质合成/降解的紧密联系。该研究表明,生长锥表现出整体泛素化水平的升高,并且蛋白降解复合体特异的降解生长锥特异表达的蛋白。因此,作者认为,轴突中引导信号的调节包含了局部特异表达蛋白的合成和降解 (Deglincerti et al., 2015;Neto et al., 2016)。
除了可以培养细胞群,并使细胞之间互相联系,器官芯片也可控制大量的机械特性如材料刚度、形状约束、间隙流和剪切应力,来研究他们对细胞状态和分化的影响 (Sundararaghavan et al., 2009;Peyrin et al., 2011;Song and Munn, 2011;Kim et al., 2013;Galie et al., 2014;Hattori et al., 2014;Asano et al., 2015;Osaki et al., 2018a)。各种生化因子也可以很容易施加在器官芯片上,以对神经发育过程的机制进行研究。通过操纵细胞因子的浓度梯度,如BMP4、SHH、FGF、RA和WNT3,即可协调细胞在早期脑组织发育中增殖、分化和器官发生 (Park et al., 2009b;Demers et al., 2016;Uzel et al., 2016;Osaki et al., 2018a)。
二、利用微流控系统来重现不同大脑区域及其连接
人类的大脑由250多个不同的区域组成,每个区域都有特异性的ECM、结构和功能(Dauth等(Novak and Kaye, 2000;Lau et al., 2013;Dauth et al., 2016)。高级的大脑功能,以及许多神经精神疾病,受海马、丘脑、小脑和杏仁核等多个大脑区域的相互作用调节 (Kato-NegiShi et al., 2013)。因此,在体外模拟不同脑区的连接具有重要意义。目前,只有少数的体外模型包含了来自两个或多个不同脑区的细胞 (Kanagasabapathi et al., 2011;Peyrin et al., 2011;Kato-NegiShi et al., 2013;Dauth et al., 2017;Soscia et al., 2017)。Peyrin等人报道了一个微流控系统,重建了一个具备功能和同步化的皮质-纹状体定向网络。使用双腔室的微流控装置培养小鼠原代皮质和纹状体神经元,并使它们通过轴突连接 (图2 A) (Peyrin et al., 2011)。研究人员借此观察到,皮质神经元触发了多刺纹状体神经元的分化和树突棘的形成。另外一种类似的微流控装置也被用于研究皮质和丘脑之间的相互作用 (Kanagasabapathi et al., 2011);基于微流控芯片的系统操作简单,可以实现体内系统中难以实现的功能(如单独研究皮质-丘脑相互作用的能力,而不受其他区域的影响。在该模型基础上开发的体外模型可以生长神经突,连接两种不同的脑组织,进行电生理和免疫组化分析(Kanagasabapathi et al., 2012)。通过使用这个体外系统,作者证明了群体放电起源于皮层区域,然后触发了皮层-丘脑网络,证实了之前从体内实验中得到的结论。
中枢神经系统模型不仅要模拟大脑复杂的神经元结构和功能,还需要考虑其独特的血管系统。中枢神经系统中血管内皮紧密连接,空洞极少,内皮细胞胞吞率非常低(Abbott et al., 2006)。大脑的血管系统包括一个高度特化的内皮细胞组成的血脑屏障,血脑屏障严密控制化合物进入大脑。因此,体外模型如果需要理解大脑对各种刺激的反应,就必须模拟由血脑屏障和血管周围系统组成的NVU与脑周细胞、星形胶质细胞和神经元密切相互作用。一般来说,确保一个给定的分子能够穿透血脑屏障,从而进入中枢神经系统是中枢神经系统药物开发中的一个主要挑战 (Herland et al., 2020)。在小分子药物开发中,计算药物分布和动物模型已经取得部分成功,但大分子生物药的快速发展,对大分子药物穿透血脑屏障模型的需求更大 (Gribkoff and Kaczmarek, 2017).
已经开发出了几种体外模型来模拟NVU(总结见表2)。最近的一个模型将一个血脑屏障芯片连接到一个脑芯片,然后连接到第二个血脑屏障芯片,其中三个芯片中包含人类BMEC、神经元细胞、胶质细胞和周细胞(图2 D)。他们使用这个系统来分析组成NVU的单个细胞类型以及神经活性药物血管内给药的效果(Maoz et al., 2018)。
在体外建模时,要充分考虑到NVU和血脑屏障的特性。体内血脑屏障特性的评估是通过测量跨内皮电阻(TEER)、对小化合物的被动渗透性 (<1000 g/mol)以及外排和内流转运蛋白的活性 (Lippmann et al.,2012;Stebbins et al., 2016)。影响这些特性的一个关键因素是构建模型的细胞来源。原代人类BMEC保留了一些血脑屏障表型。但是,人类原代BMECs的TEER(通常不超过 200 Ω /cm2 (Mackic et al., 1999;Zenker et al., 2003)。这只有大鼠和青蛙体内TEER测量值的10% (Crone and Olesen, 1982;Butt et al., 1990)。2012年以后,随着hiPSC的出现,相关研究报道了hiPSCC衍生的BMEC样细胞的TEER值为>200Ω /cm2(Lippmann et al., 2012)。但是这些BMEC细胞的性质尚存在争论。
实时监测微流控芯片上NVU的主要指标得到了广泛的关注。研究人员已经在2D和3D细胞培养芯片中整合了二维渗透率和TEER测量 (Booth and Kim, 2012;Walter et al., 2016;Wang et al., 2017;Brown et al., 2015, Xu et al., 2016a;Partyka et al., 2017)。在体外构建NVU模型时,需要考虑一些重要因素:
1. 细胞与细胞间相互作用
共培养NVU细胞为体外模型增加了另一个层次的复杂性,使该模型能够更真实地重现体内条件。BMECs与中枢神经系统细胞共培养有助于重现内皮细胞的血脑屏障特性(通过强化紧密连接和极化转运体的表达) (Kasa et al., 1991;Megard et al., 2002;Didier et al., 2002, 2003;Haseloff et al., 2005;Lippmann et al., 2012;Herland et al., 2016;Hollmann et al., 2017)。此外,研究表明,星形胶质细胞和BMECs分泌的因子可以促进彼此成熟(Janzer and Raff, 1987;Fukushima et al., 2009;Blanchette and Daneman, 2015).。
Transwell模型(表2)已广泛用于BMECs与中枢神经系统和非中枢神经系统细胞共培养;该模型允许无创TEER测量、渗透性分析和外排的评估 (Zenker et al., 2003;Colgan et al., 2008;Helms et al., 2014;Labus et al., 2014;Canfield et al., 2017;Delsing et al., 2018)。然而,这种方法反映的是单层非连续细胞的静态环境,因此不能完全重现体内血脑屏障的环境。
Siddharthan等人的研究显示,BMECs中剪切应力与紧密连接蛋白ZO-1的上调存在相关性。2011年, Cucullo报道了剪切应力对BMECs转录组的影响;剪切应力会诱导紧密连接/粘附连接、耐药转运相关基因的表达 (Cucullo et al., 2011)。
器官芯片的出现使研究人员能够在体外观察血流刺激下血管和其他细胞的功能。HBooth和Kim首次使用含有脑内皮和星形细胞系的NVU微流控芯片模型,证明片上有血流灌注的NVU的TEER高于静态水平,NVU对示踪剂的渗透性也表现出类似体内的水平。更深入的研究表明,芯片上NVU比transwell模型表现出更低的渗透性(Prabhakarpandian et al., 2013;Walter et al., 2016;Partyka et al., 2017)。
3. 细胞外基质
在体外模拟ECM是一个巨大的挑战(Rauti et al., 2019);ECM成分在整个大脑中都有所不同。不同的脑区具有独特的ECM组成,且脑血管ECM不同于脑ECM。脑血管系统中的BMEC在发育阶段的信号分子为纤维连接蛋白,成熟后改变为层粘连蛋白 (Herland et al., 2016;Adriani et al., 2017;Linville et al., 2019)。为了在体外再现NVU,应考虑脑血管系统和脑其他组织ECM的差异,以确保NVU在体外模型的准确性和有效性 (Rauti et al., 2019)。
大多数iPSC衍生的BMECs方案联合使用IV型胶原和纤维连接蛋白作为BMEC分化过程中的诱导因子 (Lippmann et al., 2012, 2014;Hollmann et al., 2017)。然而,其他类型的ECM成分也在体外的NVU中使用,如I型胶原蛋白。尽管I型胶原蛋白不存在于人类大脑中,但I型胶原蛋白的成胶特性使其在NVU的3D体外生成中非常有效 (Herland et al., 2016;Partykaet al., 2017;Wevers et al., 2018;Grifno et al., 2019;Linville et al., 2019)。ECM衍生的凝胶已被应用于微流控装置中,为现有的流体模型增加了另一层复杂性(Herland et al., 2016;Adriani et al., 2017;Linville et al., 2019)。
缺乏合格的中枢神经系统体外模型是中枢神经系统药物开发成功率低的一个重要原因(Kesselheim et al., 2015; Gribkoff and Kaczmarek, 2017);较低的药物开发成功率又导致许多大型制药公司缩减了它们在神经系统领域的研发投入(Wegener and Rujescu, 2013)。
为了更好的模拟健康和病理条件下中枢神经系统的生理特征和功能,许多学术和产业研究人员开始使用iPSCs (Shi et al., 2017),器官/类器官芯片(Pasca, 2018),水凝胶3D打印(Hopkins et al., 2015)等技术来建立新的体外模型。虽然这些方法仍无法完全复现人类大脑复杂的生理学、解剖学特征和功能,但他们在模拟体内功能和发病机理,揭示现有体外模型无法发现的生理互作方面展示了光明前景。
1. 包含所有的功能细胞类型。中枢神经系统是一个复杂的细胞网络,由神经元、星形胶质细胞、少突胶质细胞、周细胞、免疫细胞和血管内皮细胞组成,并生长在组织特异性的细胞外微环境中 (Rauti et al., 2019)。了解中枢神经系统的机理对于识别潜在的药物靶点,预测药物副作用,了解神经系统疾病的发病机制至关重要。
2. 充分模拟细胞外环境。除了包含不同的细胞亚型,合格的中枢神经系统体外模型还必须重现细胞外环境,包括特殊的细胞组织形式和细胞间的相互联系。因此,在构建模型时,必须尽可能重新细胞外基质(ECM)的物理、化学和机械特性(Frantz et al., 2010; Abdeen et al., 2016; Uwamori et al., 2017)。
大脑ECM由三个基本的结构组成:基底膜、神经周网和间质基质(Novak and Kaye, 2000; Yamaguchi, 2000; Bonneh-Barkay and Wiley, 2009; Lau et al., 2013; Rauti et al., 2019)。基底膜主要由IV型胶原、层粘连蛋白-核原复合物、纤维连接蛋白、硫酸肝素蛋白聚糖(perlecan和agrin)和大量的生长因子组成(Baeten and Akassoglou, 2011;Xu et al., 2019;Barcelona and Saragovi, 2015)。神经元周网主要由透明质酸、蛋白聚糖组成。间质基质则由蛋白多糖、透明质酸、肌腱蛋白和纤维蛋白组成 (Novak and Kaye, 2000;Rauti et al., 2019)。大脑ECM外环境是细胞迁移的物理支持,也传递影响细胞生长和分化的机械和生化刺激 (Garcı´a-Parra et al., 2013;Levy et al., 2014;Potjewyd et al., 2018;Rauti et al., 2019)。
目前广泛使用的中枢神经系统体外模型包括二维和三维细胞培养模型 (Zhuang et al., 2018)。原代细胞或组织培养模型保留了大多数细胞原位特征,比较如实地反映细胞形态和功能信息(Balgude et al., 2001;Hopkins et al., 2013)。但是,它们仍存在长期保存后活性降低,传代能力的缺陷以及细胞成熟后多样性的问题( (Walsh et al., 2005;Gahwiler, 1981)。另外这些模型通常是动物来源的,因此缺乏人类大脑的复杂环路和结构(Herculano-Houzel, 2014; DeFelipe, 2015;Hopkins et al., 2015)。
人类来源的干细胞和hiPSCs为开发可规模化复制的人类中枢神经系统模型创造了机会 (Dubois-Dauphin et al., 2010;Hopkins et al., 2015;Pacitti et al., 2019;Silva and Haggarty, 2020)。此外,3D体外培养系统(图1 C)可以再现复杂的细胞间相互作用,更加逼真的重现体内细胞微环境。新的3D中枢神经系统模型,如神经球和类器官(Hogberg et al., 2013),主要以干细胞技术为基础开发。神经球(图1 D)是自组装的致密结构,主要由神经干细胞、神经元和胶质限制性祖细胞、有丝分裂后的神经元细胞和死亡(濒亡)的细胞组成。神经球是研究神经发生和神经发育的有价值的系统,也是一个近乎无限的神经元和祖细胞的来源。神经球的一个主要问题是:由于对氧气和营养物质的获取能力有限,生长在神经球中心的细胞会死亡 (Bez et al., 2003;Jensen and Parmar, 2006)。其它缺点包括:神经细胞经过几轮传代后会丧失干细胞潜能,不同实验室之间培养的神经球实验结果重复性较差。
Lancaster and Knoblich (2014)首次引入了人类大脑类器官的概念(图1 E)。人类大脑类器官是一种来源于多能干细胞的自组装细胞群,具有早期胚胎中枢神经系统的谱系和结构。大脑类器官的使用已经呈指数级增长(Lancaster et al., 2013;Mariani et al., 2015;Jo et al., 2016;Raja et al., 2016;Lee et al., 2017)。鉴于类器官可使用基因组编辑技术,因此它对识别和测试新的治疗方法特别有用 (Yin et al., 2016;Gonzalez-Cordero et al., 2018;Pellegrini et al. 2020)。最近发表了一些体外类器官模型,展示了人类脉络膜丛的关键功能,屏障形成和脑脊液分泌,均展示了类器官模型的巨大潜力。类器官的缺点包括:它们自发形成的特性使得类器官在细胞类型和组织方面的可重复性较差。类器官也缺乏许多对器官生理功能至关重要特征,如血管灌注、机械刺激和循环免疫细胞的存在等(Ingber,2016)。
结合当前体外和体内模型的优势【表1】,科研工作者开发了器官芯片平台。在器官芯片中,细胞和组织在微腔室中培养,整体的微环境也可以得到很好的控制(Meyvantsson and Beebe, 2008;Meer and Berg, 2012;Halldorsson et al., 2015;MacKerron et al., 2017;Osaki et al., 2018;Sosa-Herna´ndez et al., 2018;Oddo et al., 2019)。最简单的器官芯片平台是一个单一的、可灌流的微腔,在其中可以生长一种细胞或多种细胞混合物。在更复杂的设计中,同一芯片中的两个或多个腔室被膜、通道或凝胶分开,以培养不同的细胞类型,各腔室的细胞直接接触或通过分泌物来传递细胞间的相互作用(图 1F和图 2)。在更高的层次上,通过连接两个或两个以上的器官芯片(图 1F),即可模拟不同的组织或区域的相互作用,实现更加复杂的功能(如血脑屏障) (Bhatia and Ingber, 2014;Phan et al., 2017;Oddo et al., 2019)。这些多芯片系统让研究多器官生理系统成为可能(Esch et al., 2014;Maschmeyer et al., 2015;Ingber, 2016)。
器官芯片有几个关键的优势:
1. 器官芯片设计灵活,制造成本低。
2. 与传统的细胞培养形式相比,污染风险低,试剂消耗少,实验通量高(Halldorsson et al., 2015)。
3. 血液流动和剪切应力可以得以模拟 (Bhatia and Ingber, 2014;Bischel et al., 2015;Benam et al., 2016;Ingber, 2016)。
然而,也有一些障碍限制了器官芯片的使用,这些障碍包括相当长的原型设计时间,缺乏标准化的实验步骤,需要专门的设备和复杂耗时的制造过程 (Coluccio et al., 2019)。
为了克服这些问题,研究人员一直在开发基于3D打印的(【图2】 G和H )的体外脑模型 (Lozano et al., 2015;Han and Hsu, 2017;Hampson et al., 2018;Sivandzade and Cucullo, 2018)。3D打印可以使用不同的材料(包括活细胞)沿着中枢神经系统的z轴来制作具有生物活性的3D结构,从而构建中枢神经系统体外模型 (Xu et al.,2006; Gu et al., 2016, 2018;Bishop et al., 2017;Han and Hsu, 2017;Thomas and Willerth, 2017;Knowlton et al., 2018;Potjewyd et al., 2018;Oliveira et al., 2019)。3D打印的体外模型可定制设计,精确制造更可靠的体内神经组织,以保证在临床研究和药物筛选过程中的一致性。但是,在3D打印中,需要开发出对细胞刺激最小的3D打印方法、保证模型可重复性、更好地复现体内神经组织中的分子梯度,设计细胞外基质、并对模型进行充分的验证 (Rauti et al., 2019)。
目前大多数器官芯片都相对较薄(100-1000 微米高,在这些结构中的细胞层更薄)。因此,与传统的3D培养不同,这些器官芯片通常与实时成像设备兼容,可用来做细胞迁移分析和传统的免疫组化评估。例如,Deosarkar 等使用共聚焦显微镜对器官芯片中的独立血管通道进行成像,成像尺寸为200*100*2762微米(Deosarkar et al,, 2015)。双光子显微镜最新技术发展,人工智能和机器学习辅助的先进3D成像技术 (Joshi et al., 2018;Masullo et al., 2018;Puls et al., 2018; Scheeder et al., 2018;Booij et al., 2019)和生物传感器的集成(Misun et al., 2016;Maoz et al., 2017),hiPSC衍生的细胞援建有望推动3D体外建模的进展。最近评估表明,生物传感器、微流控技术和组织培养的结合可能很快就会大幅度减少基于动物模型的研究(Dove et al., 2018)。
除了基于细胞的体外平台的外,基于纯理化和计算的体外模型的发展也很重要,部分可以作为基于细胞的模型的替代品。这类模型包括固定化人工膜测量(IAM)、平行人工膜渗透性测量(PAMPA)和固体支持磷脂膜测量(TRANSIL)(Vastag and Keseru, 2009;Sharma et al., 2019)。基于计算模型和模拟,如机器学习和深度学习方法也正在变得越来越复杂(Yuan et al., 2018),可以用来补充甚至替代一些生物学实验。基于计算的模型提供了合成、预筛选和虚拟测试新药物的可能性,降低了实验室实验和昂贵的临床试验的需要,加速了药物开发过程 (Naik and Cucullo, 2012;Alsarrani and Kaplita, 2019;Chlebek et al., 2019)。然而,这些基于非细胞的模型验证还不够充分,通过这类研究获得的结果必须通过体外和体内研究来验证 (Naik and Cucullo, 2012)。
事实上,确保一个模型忠实地再现了体内的生理、病理过程,对于任何模型在转化医学中应用都是必不可少的。由于中枢神经系统生物学上的复杂性,验证体外中枢神经系统模型格外具有挑战性。因此,需要巨大的努力来确定中枢神经系统体外模型能在多大程度上代表体内的反应。例如,Belle等最近使用电生理方法来对比体内和体外培养的皮层神经元之间的差异。对于任何模型来说,体外到体内的比较都至关重要 (Frazier, 1990;Belle et al., 2018;Jones et al., 2018)。
另一个阻碍中枢神经系统体外模型应用于转化医学的障碍与它们所使用的细胞有关。例如,虽然器官芯片的主要目的是模拟人体内的微系统,但本文中引用的许多器官芯片研究都使用动物细胞,而不是来自hiPSC的细胞(表1)。尽管我们相信基于hiPSC的器官芯片有很大的希望应用于未来的精准医疗,但即使是基于hiPSC的系统也不可能完全预测体内的结果(Doss and Sachinidis, 2019;Ortuno-Costela et al., 2019)。由于科学家们在体外体系中使用hiPSCs仍然面临的巨大困难,因此目前的体外模型还依赖于非hiPSC来源的细胞,大大限制了其在转化医学中的指导作用。