实验目的： 参照Moderna和BioNtech的新冠疫苗配方，以MC3和SM102为主要脂质，制备包载mRNA的脂质纳米颗粒（LNP）。
实验原理： MC3和SM102是两种可解离脂质，在酸性条件下可质子化形成阳离子脂质，通过静电作用于带负电的mRNA结合，形成载有mRNA的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNPs)。在本实验中采用微流控混合法，让脂质溶液与和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的形成粒径均一的LNP。由于脂质溶解于乙醇中，核酸溶解于酸性缓冲液中，因此需要透析或者超滤去除残余的乙醇并将溶液体系置换至PBS中。
实验材料： 1.配制脂质-乙醇溶液：
LNP 的成分与分子量见下表：
百分比来源于前期研究，并不一定与onpattro和mRNA-1273相同。
所有成分总浓度配置成12 mM（约7.5 mg/ml）的浓度。如果需要摸索磷脂对LNP Final粒径的影响条件，可以配制以下浓度：8 mM（约5 mg/ml）、12 mM（约7.5 mg/ml）和16 mM（约10 mg/ml）。
2.计算mRNA浓度：
根据N/P=6，FRR=3计算所需RNA浓度。
RNA的碱基的平均分子量为324，每个碱基携带1个磷酸，因此RNA中的含磷量为3.1 nmol/μg.
计算氮磷比时仅计算主要脂质中的氮原子数，因此每摩尔混合脂质中含有0.5摩尔N。
3.配制mRNA-柠檬酸缓冲液：
使用超纯水分别配制100 mM的柠檬酸(分子量:210.14，称取1.05 g)和柠檬酸钠(分子量:294.10，称取1.47 g)溶液各50 ml。
取33.0 ml柠檬酸溶液和17.0 ml柠檬酸钠溶液，混合后加入DEPC，静置30分钟后高压灭菌去除DEPC，灭菌后使用DEPC水定容至100 ml即得50 mM pH=4的柠檬酸缓冲液。
将mRNA测定浓度后根据脂质浓度使用柠檬酸缓冲液稀释至所需浓度。
4.微流控混合：
一、装配微流控混合芯片和夹具：
步骤一、如图1所示，打开夹具。
步骤二、如图2所示，装入LNP混合芯片，注意芯片开口方向（ FluidicLab logo正面），芯片开口和夹具开口对准，芯片要完全陷入卡槽中。
步骤三、如图3所示，合上卡扣，芯片装载完成。
如图4所示，将夹具放置在托盘上，托盘下放置废液管和样品收集管。将磷脂溶液和mRNA溶液导入，即可制作LNP。
二、预冲洗管路和微混合芯片：
预冲洗保证微混合芯片内部已经预先充满乙醇和柠檬酸缓冲液。
1. 将无水乙醇和柠檬酸缓冲液通过0.22微米微孔滤膜过滤。
2.将无水乙醇吸入3 ml注射器中（吸入体积约0.7 ml），将柠檬酸缓冲液吸入3 ml注射器中（吸入体积约2.1 ml），并排出注射器中的空气。在注射器上标注“乙醇”和“缓冲液”。
3.分别将“乙醇”和“缓冲液”注射器和样品导入管连接，并安装在注射泵上，如下图所示。
组装完成的注射泵和芯片夹具如图所示：
4.按照以下步骤选择合适的注射器型号，注射体积和流速（以LNP-B1为例,总流速12 ml/min）。
将废液管放置在样品流出管下，收集流出的废液。
点击开始，开始冲洗管路和芯片。
三、微流控混合制备LNP：
1.分别将分别将脂质-乙醇溶液和mRNA-柠檬酸缓冲液通过0.22微米滤膜过滤。
2.将脂质-乙醇溶液吸入3 ml注射器中（根据需要，至少需要吸入0.5 ml），将mRNA-柠檬酸缓冲液吸入3 ml注射器中（至少吸入1.5 ml），并排出注射器中的空气。
3.将注射器出口和样品导入管连接，并固定在注射泵上。
4.用户可根据具体需要来调整注射泵的流速和混合体积。推荐起始设定如下：
5.点击运行，观察流出管流速稳定后（一般需要丢弃前100-200微升液体），用收集管收集流出的液体。一般在注射结束前1-2秒停止收集，丢弃*后1-2秒流出的液体（若配备自动切换前后废的装置，则需要在软件中设置）。
四、透析（或者超滤）与储存：
透析：
1.样品收集后，立即用30倍体积的PBS将乙醇浓度稀释到1%以下。
2.使用动态光散射仪测定LNP粒径和均一度。正常结果如下图所示：
3.制备后放入透析管（Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL）中加入14 ml PBS在摇床上透析，2小时后换液，放置摇床直至18小时后透析结束。一般透析或者超滤后粒径和PDI均会略微增大。
4.保存于含有2%蔗糖的PBS，-80℃冻存。
超滤:
1.样品收集后，立即用30倍体积的PBS将乙醇浓度稀释到1%以下。
2.使用Milipore 30 KD超滤管，3000 g离心20分钟进行超滤。
3.保存于含有2%蔗糖的PBS，-80℃冻存。
实验名称：LNP包封率测定 实验目的： 对制备的LNP包封mRNA的效果进行测定。
实验原理： Quant-iT™RiboGreen®RNA试剂是一种超灵敏的荧光核酸染色剂，可检测溶液中1-200 ng的核酸，这种核酸染料无法透过LNP，因此只有游离的未被LNP包载的核酸可以被结合。Triton-100作为一种表面活性剂常被用做破乳剂，使用1%的Triton-100处理获得的LNP-mRNA可以使包载的核酸释放，得到总核酸量。通过计算破乳前后核酸量的差异得到载药量，再除以总核酸量即可得到包封率，即：
包封率（%）=（破乳后定量-破乳前定量）/破乳后定量
实验材料： Quant-iT™ RiboGreen™ RNA 检测试剂盒（Thermo Fisher，R11490）
Triton™ X-100 （SIGMA-ALDRICH，T8787-100ML）
DEPC水
CellCarrier-96 Ultra Microplates （ PerkinElmer，6055308）
实验步骤： 1.LNP制备
见LNP制备流程。
2 .试剂准备（详细参见说明书）：
将20xTE用DEPC水稀释至1x；
用稀释好的1XTE稀释试剂盒中的标准品，稀释成2 μg/mL及100 ng/mL两种终浓度；
用1xTE稀释试剂盒中的QuantiT™ RiboGreen® Reagen，稀释成200倍及2000倍两种终浓度；
按照下表在CellCarrier-96 Ultra Microplates中加入以下试剂，做复孔：
High range Low range 3.LNP破乳
将Triton-100用1xTE稀释到2%，取100 μl加入CellCarrier-96 Ultra Microplates，加入1 μl制备好的LNP，处理5分钟，加入100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。
4.LNP游离核酸测定
在CellCarrier-96 Ultra Microplates中加入100ul1xTE，取1μl制备好的LNP加进去，混匀，加入100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。
5.读板
使用SPARK读取荧光强度，激发光设置为480 nm，发射光为520 nm
6.数据处理
1) 标曲制备
2) 样品定量
载药量=破乳后读值-破乳前读值
包封率（%）=载药量/破乳后读值
Fluidiclab LNP制备系统（科研级） 使用操作视频演示
