患者来源类器官已成为一种有效的体外癌症研究模型。与2D细胞系、3D细胞系和原代细胞培养相比，患者来源类器官已被应用于药物筛选，以证明基因突变与靶向治疗敏感性之间的相关性。类器官也被用于联合临床试验，以比较类器官的药物反应与相应患者的临床反应。许多研究已经成功地使用类器官来预测癌症患者的治疗反应。利用微流控技术大规模的培养患者来源的类器官，显示了在高通量药物筛选和促进临床治疗决策方面的巨大前景。

四种体外肿瘤细胞培养模型的比较。

二维细胞系：从ATCC中获得细胞后，可在10cm的培养皿中培养。

3D细胞系：从ATCC中获得细胞后，可以在低黏附96孔板中生长。

2D原代细胞：从膀胱癌肿瘤中获得原代细胞后，这些细胞可以在10厘米的培养皿中生长。经过几代后，它们失去了异质性。

类器官：从膀胱癌肿瘤中获得原代细胞后，这些细胞可以在metrigel微滴中生长为类器官。

现有的体外肿瘤模型：

二维细胞系

细胞系来源于获得致癌突变的细胞，他们主要在二维平面上生长。虽然二维细胞系已经在药物筛选上得到广泛的应用。但是，这些模型仍然有很大的局限：

1、无法模拟细胞生长的微环境，无法真实的反映细胞异质性，相邻细胞间、细胞与胞外基质复杂相互作用无法得到真实呈现。

2、虽然许多癌细胞系携带在相应癌症中发现的重要基因突变，但并不一定包含这些癌症所有的基因突变。例如，7种已建立的前列腺癌细胞系均不携带在患者中发现的SPOP突变和FOXA1突变。

3、肿瘤细胞系的基因组成在传代和不同的实验室条件下会发生显著变化。例如，之前对27株MCF7细胞系进行抗癌化合物检测时，发现他们对药物反应非常不同。

3D细胞系 

替代2D细胞系的一种方法是将细胞系三维培养形成球状体。与2D培养相比，3D细胞培养明显的改善了细胞形态、力学性能、分化和活力。细胞在3D培养中的药物代谢和分泌行为也使3D细胞团更适合药物筛选。 

虽然3D细胞培养克服了2D细胞培养中微环境的问题，但是2D细胞培养中的一些根本问题，如细胞异质性无法呈现、细胞系在传代过程中呈现出的多样性等问题均无法得到解决。

原代细胞培养

原代细胞培养提供了一种更个性化的细胞培养方式。它允许科学家使用与个体患者相同的细胞，而不是使用来源于一个患者样本的细胞来代表患有该特定疾病的所有患者。培养原代细胞包括从新鲜的病人组织中获取细胞并进行体外增殖，但是培养原代细胞仍存在许多困难。

1、许多细胞在培养后不久就停止生长。

2、在多次传代后，分裂速度快慢不同的细胞发生了明显的基因表达分化。

3、多次传代后，细胞种群的比例发生了明显的变化。

患者来源的类器官(PDOs)

PDOs拥有3D细胞系、原代细胞系的优点，又克服了各自的局限，是目前*有前景的细胞培养技术。

简单地说，培养PDOs首先将病人组织粉碎，并将回收的细胞置入基质胶或ECM中，体外培养使PDOs持续生长，*终生长为被称为“类器官”的球体。生长良好的类器官保留了原始肿瘤的遗传图谱和组织学特性。PDOs具有巨大的优势：

 1. 肿瘤类器官可以从常规癌症活检获得的组织培养，成功率高，使其可以探索肿瘤发生不同阶段的变化。

 2. 基因表达谱在PDOs中往往保持更稳定。

 3. PDOs具有高度的可重复性。研究表明在大多数情况下，PDOs表现了对特定药物的同质反应。 

4. 肿瘤类器官也可以冷冻保存、扩增、基因分析和迅速进行药物处理。

PDOs用于指导临床治疗

在癌症治疗中，都会在手术切除肿瘤前后都使用药物进行辅助治疗。这些药物主要用于化疗、靶向治疗、放疗，以及近年来的免疫治疗。不同患者有不同的基因背景和体内环境，这可能会影响他们对某些药物的反应。因此，需要一个个性化的模型系统中测试这些药物。 

通过研究PDOs和患者对相同药物反应的的相关性，可以检测PDOs在治疗方案选择中的有效性。 

临床通过比较胃食管癌患者和来源于患者的类器官对紫杉醇的耐药性，证明了两者之间具有高度的相关性。另一项关于12名患者和患者来源类器官的研究显示，患者对tamoxifen的体内反应与乳腺癌类器官体外反应呈正相关。

 2019年的一个临床病例也显示了PDOs在指导肿瘤化疗方案中的有效性。一个结直肠癌转移患者*初接受了联合药物化疗方案，包括药物5-FU、leucovorin和奥沙利铂。不幸的是，化疗完成4个月后肿瘤继续进展。为了决定是否坚持该治疗方案，首先用肝转移活检组织培养出类器官，然后使用药物来处理，并分析了类器官直径和氧化还原比，结果支持继续使用该化疗方案。后续的治疗效果也证明该化疗方案确实减少了肝转移肿瘤的体积。 

另外一项临床研究表明，患者和PDOs对放疗的敏感性高度相关，在一个80个病患样本的研究中，68个PDOs显示了和患者相同的反应。

微流控高通量患者来源类器官(PDO)培养方案

本文介绍的方法主要参考以下文献：

* “Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids”

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在微液滴中包裹单细胞和带有条码序列的水凝胶微球是高通量单细胞测序的基础。通过在微液滴中完成条码引物的释放、细胞裂解和扩增等操作，我么可以对单细胞的转录组、表观遗传组等组学信息进行高通量和深度的覆盖，又兼顾了单细胞的分辨率。单细胞组学技术是生物、医学*有潜力的技术之一。

目前单细胞包裹系统的推广受制于以下几个问题：

1. 微流控包裹系统昂贵的价格。2. barcode水凝胶微球合成困难。3. 微流控芯片和试剂价格昂贵。

FluidicLab定制化的单细胞包裹平台，专为科研用户推出。Fluidiclab提供*高性价比的的微流控芯片单细胞制备系统、可控降解barcode水凝胶微球、PFPE-PEG微滴生成油，使得科研工作者可以在5分钟内就开始自己的单细胞包裹实验。

正在进行中的单细胞包裹实验，左侧蓝色为细胞悬液，右侧为可降解的barcode聚丙烯酰胺微球，粒径约为70微米。

包裹完成的微滴，98%以上的微滴中只有一个水凝胶微球，大于60%的细胞均被包裹在微滴中。

由于气体的可压缩性，使得微气泡在超声成像造影和药物输送方面有着广泛的用途，越来越受到各行业的关注。微气泡作为超声造影*初是为了改善超声信号，增加组织边界和特征的描绘。它是基于气体的可压缩性使得微气泡比周围的血液和组织更有效地散射超声能量，从而使其成为血管成像的有效探针。早在1968年，Gramiak等通过研究发现在心导管注射生理盐水时，随着注射所产生的微气泡使得在主动脉中观察到造影现象。尽管在二十年前，微气泡作为药物输送的载体在临床应用上还很概念化，但目前正在进行的一些研究已经取得了明显的进展，如作为基因的载体用于基因治疗、作为给药载体将药物送到指定区域等，这表明在不久的将来微气泡很有可能应用于临床。

理想的微气泡具有高稳定性和高单分散性。前者主要取决于其外壳成分，外壳中含有高浓度的表面活性剂，可以在微气泡表面形成类似固化的粘结剂，以此减缓气泡与气泡间的融合。然而，后者实现高单分散的微气泡仍是一个挑战。当前主要采用超声或机械搅拌方法产生微气泡，这类方法虽具有简单、方便和成本低等优势，但是产生的微气泡大小均一性差。由于超声成像造影和药物输送受共振频率影响，而共振频率范围的选择又取决于直径大小，所以生成粒径均匀的微气泡很有必要。

为了提高微气泡的均匀性，其他各种方法也被相继报道。其中基于微流控方法制备出平均直径 <10 μm的单分散气泡悬浮液是*有力的方法之一。因此，在这里我们通过FluidicLab微气泡平台提供的微气泡生成芯片和对应夹具，用户只要简单的连接管路，三分钟内即可完成微气泡的生成。

双乳液滴是化妆品、制药或食品工业非常有前途的材料。双重乳滴可用于封装比较敏感的化合物（药物、维生素、香料……），保护活性物质，并*终根据需要在合适的时间和地点释放封装的化合物。

双乳液滴的获得非常复杂。借助微流体技术可以高效稳定的生成双乳微滴。目前常用的生成微滴的结构为以下三种：co-flow，T-junction，flow focus。这三种结构均可用于双乳液液滴的形成。生成双乳液滴*简单的几何形状是连续的两个流动聚焦结构。在第一个流动聚焦处形成的液滴在第二个流动聚焦处被封装到外部液滴中。

通常，双乳液是用含两种性质不同的表面活性剂的分散相分两步制备的。例如，要形成水包油包水乳液，首先将水用含有疏水性表面活性剂的油相乳化，然后在第二步中用含有亲水性表面活性剂的水相重新乳化。

使用玻璃毛细管可有效产生双乳液液滴，但组装起来比较困难，重复性较差。比较稳定可靠的方法是使用局部改性的微流控芯片来进行。

FluidicLab双乳化微滴平台提供已经进行局部改性的双乳化微滴生成芯片和对应夹具，用户只要简单的连接管路，五分钟内即可完成双乳微滴的生成。

*近，一个客户提出了一个实验需求：使用压力控制器和玻璃毛细管来精确可控的完成吸取和释放单个细胞的过程，并寄了一批内径40微米的玻璃毛细管给我们。

我们的测试条件相对简陋，一个三维位移台用来精确控制毛细管末端在培养皿中的位置；一个3D打印的毛细管固定架用来连接玻璃毛细管和三维平移台；一根橡皮筋用来固定玻璃毛细管到毛细管固定架上；一段硅胶管用来连接压力控制器和玻璃毛细管，将压力控制器的输出压力导入到毛细管中；整个显微操作部分的制作，成本大概500元左右。

1、压力输出范围：-1 mbar到+1 mbar

2、压力输出范围：-2.5 mbar到+2.5 mbar

3、压力输出范围：-5 mbar到+5 mbar

从结果来看，抽取和释放的液体体积和压力呈简单线性关系，抽取和释放的频率也和压力控制器的设定同步，压力控制器出色的完成了任务。我们的简易微操平台也非常稳定的控制着玻璃毛细管在液体中的位置。

如果换成电动平移台的话，应该可以实现毛细管在孔板和培养基之间的程序化移动，配合吸取和释放细胞的操作，就可以作为一个简单的细胞显微操作仪使用。

这里我由衷的感到伟大祖国制造业的强大，让我们用*低的成本做了一台价格十多万美元的细胞操作仪的事情。

微气泡是超声成像常用的造影剂。由于血细胞对超声波散射微弱，导致超声图像对比度很差。为了解决这一问题，微气泡造影剂被开发出来增强声学信号。

为了提高超声成像的对比度和治疗效果，必须严格控制微气泡的大小和表面特性。一个理想的微气泡必须大小均一、不随时间变化。

目前商用的超声造影剂大多由直径小于10 μm的微气泡组成。95%至98%商用的微气泡直径小于5 μm，直径标准差在0.35-0.47 μm之间，浓度一般为108到1010个/毫升。商品化的微气泡通常用磷脂或蛋白质来稳定气液界面，内部通常充满全氟碳气体，如八氟丙烷或六氟化硫，以提高稳定性。

目前*常用的产生微气泡的方法是超声和机械搅拌，这两种方法虽然简单和便宜，但是产生的气泡大小均一性很差，而生成高度均一的微气泡正是微流控技术的优势所在。

1、如何使用微流控技术制作微气泡

目前制作微气泡*成熟的微流控结构仍然是流动聚焦结构，如图1所示。

图1、经典的流动聚焦结构。中间相为气体相。上下两相为连续液体相。

在产生直径小于10 μm微气泡的微流控结构中，流动聚焦结构是目前应用*广泛的。流动聚焦结构由两侧面的连续相和中间的气体相组成，在V形喷口处气体被连续相的液体剪切产生微气泡，出口通道角度或通道高度（14 μm到28 μm）的变化不影响气泡形成。通过增加连续相流速，降低气体流速与连续相流速的比率，可以产生直径很小的微气泡。

2、如何改变微气泡的大小

在使用流动聚焦结构时，除了气体相和连续相的流速比例外，连续相的粘度也会影响所产生的微气泡的大小，粘度的降低会生成更大的气泡。稳定的微气泡直径通常小于通道的高度，但大于喷口的直径。

改变喷口的尺寸是调整气泡直径的另一种方法。可以通过改变流动聚焦处喷口的尺寸来动态改变微气泡的直径。通过在微流体装置中加入一个压力驱动阀，并在喷口两侧设计可以导入空气的臂，就可以动态的调整喷口尺寸来调整气泡大小(图2a)。增加阀门的气体压力，喷口缩小，产生较小的气泡。降低通入阀门气体压力则可形成更大的气泡。

图2、a：动态调整喷口的流动聚焦芯片设计；b：通过真空调整微气泡尺寸的微流控结构

另外一种调整微气泡大小的方法是将真空应用于蛇形通道中，由于PDMS具有透气性，气泡中的气体可通过PDMS芯片中的蛇形通道的外壁扩，扩散到旁侧的真空通道中(图2b)。实验表明，在不施加真空时，气泡直径收缩10 μm (95 μm到85 μm)，施加真空后气泡的直径缩小到5 μm并可长时间处保持不变。

3、使用微流控技术大规模的生产微气泡

目前实验室使用超声的方法生产微气泡，产量可以达到108个/秒。虽然微流控技术在产生高度均匀的微气泡方面有优势，但生产效率很低，大多数情况下生产率为<104个/秒。

气泡产生装置的平行化可增加了微气泡的生产效率，通过数个甚至数百个流动聚焦装置，可以大幅度的提高生产效率。

另外一种改进的流动聚焦结构具有两种气泡形成机制：气泡流或气泡喷雾(图3)。通过在流动聚焦喷口后宽出口通道和突然加倍通道深度，引入突然的压降来实现的大量微气泡生成。在气泡喷雾状态下，生产速度可以达到106个/秒（235mL/h）。

图3、a：气泡流模式；b：气泡喷雾模式

4、微气泡外壳和填充气体的选择：

常用的微气泡的填充气体多为空气或者氮气。由于空气和氮气较易溶于水，长时间后会造成微气泡体积的缩小和气泡融合。目前常用的填充气体为水中溶解度很低的八氟丙烷、全氟丁烷或六氟化硫。

相较而言，外壳成分对微气泡稳定性的影响更大。为了稳定微气泡的气液界面，微气泡的外壳中经常含有高浓度的表面活性剂。这些稳定剂吸附在气泡的表面，阻止气泡融合并减缓气体的溶解。脂类是气泡外壳中*常用的表面活性剂，主要的脂质成分是磷脂，如：

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)、

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocho line (DPPC)。

1,2-dioleoyl sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (DOPE-B) 和

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE) 、

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phos phate (DPPA)。

用于微气泡的其它稳定剂包括高分子聚合物，如聚环氧乙烷-聚环氧丙烯-聚环氧乙烷（(PEO)x-(PPO)y-(PEO)x，也称为Pluronic）。

纳米颗粒是指粒径小于100 nm的颗粒。纳米颗粒的主要成分是碳、金属、金属氧化物和有机物。纳米颗粒在药物递送、成像和生物传感等领域显示了巨大的应用潜力。由于拥有很大的表面积/体积比，纳米颗粒表现出许多独特的特性。由于纳米颗粒的理化性质主要取决于其大小和形态，合成具有可控大小和形状的纳米颗粒就显得格外重要。微流控技术可以更精确的控制纳米颗粒的大小和形状，合成的纳米颗粒粒径分布也更窄，因此在微流控器件中合成纳米颗粒比传统合成工艺更具优势。本文将概述使用微流控芯片合成纳米颗粒的方法，以及较传统合成方法的优势。

传统合成纳米颗粒的方法

传统合成纳米颗粒的方法有两种：“自下而上”的方法如沉淀、溶胶-凝胶和热解，或者“自上而下”方法如机械研磨、纳米光刻和热分解。纳米颗粒的形成过程可以分为以下几个阶段：通过物理激活/混合起始反应、颗粒成核、颗粒生长和颗粒形成。通过改变反应参数和条件，可以形成合适大小和形态的纳米颗粒。由于宏观反应中的反应条件随机波动大，批量反应中颗粒混合和分离更加困难，控制反应条件在技术上格外具有挑战性。直接后果就是纳米颗粒粒径不均一和批次差异大。这些问题的存在，都推动了微流控技术在该领域的应用发展。

利用微流控技术生产纳米颗粒

微流控器件可以高度重复和高通量的方式制备纳米颗粒。微流控芯片可以操控微米尺度通道中的流体，被广泛应用于纳米技术领域。微流控芯片中的微反应器通常是管状结构，内部尺寸通常小于一毫米，纳米颗粒的合成在微反应器中进行。微流控芯片通常用高分子聚合物，如PDMS或玻璃制成。多篇发表文献已经表明，使用微流控装置可大幅度提高反应得率，并改善粒径和形状分布。用微流控系统[6]也可以合成各种形状的非球形颗粒。

图1、纳米颗粒合成方法的示意图。(a)批量法；(b)单相流；(c)气液多相流；(d)液液多相流。Ma et al. “Controllable synthesis of functional nanoparticles by microfluidic platforms for biomedical applications”

 

可应用于纳米颗粒合成的微流控系统分为两类：

单相连续流体系统

多相流体系统

1、单相连续流体系统

单相连续流系统是第一种成功合成纳米颗粒的微流控装置。各种类型的纳米颗粒，如胶体金、量子点和脂质体，均可在单相系统中通过自组装和纳米沉淀制备出来。

在单相系统中，单一流体或多个流体形成的连续层流流过微反应器，成核和生长均在微反应器中发生。单相系统确保了整个反应的条件均一，反应物能够快速扩散和混合。在微流控芯片中，反应物混合主要通过层流扩散，通过控制微流控芯片中通道的几何形状可以用来精确地控制混合和反应时间，从而高度重复地形成预期尺寸和形状的纳米颗粒。单相系统允许在连续反应或多步反应过程中添加试剂，提供了反应条件控制的灵活性。反应的放大也较为直接，通过在同一芯片上同时进行多个反应既可提高产量。

图2、单向连续流反应体系。Wang et al. ”A rapid pathway toward a superb gene delivery system: programming structural and functional diversity into a supramolecular nanoparticle library”

2、多相反应体系

具有多相流的微流控装置，也被称为分段流或液滴微流控。它由两种或几种不可混溶流体形成分散段。流动相可以是液体（通常是油/水或水/油体系）或者气体。分散段作为小的单独反应室，当分散段在微流控芯片通道内移动时，在每个段内均发生混合和反应。与单相系统一样，微通道的几何形状可被设计来优化混合和反应时间。液滴的体积通常在皮升左右，小的反应体积有利于高效的热交换和提高反应速度。

反应在空间上进行隔离降低了相互污染和通道堵塞的风险，也提高了合成的重复性。但是，在需要多步反应和连续修饰的时候，因为很难在封装的液滴中添加试剂，所以多相系统不如单相系统灵活。与单相系统一样，多相系统也可以通过并行以增加产量。

应用微流控技术生产纳米颗粒的优劣比较

与传统合成技术相比，微流控系统在合成纳米颗粒时有以下几个优点。具体优缺点如下：

优势：	缺点和挑战：
高重复性	存在污染和通道堵塞的风险
试剂消耗量较低	纳米颗粒可以通过PDMS扩散
方便控制实验参数	自动化比较困难
混合效果更好	复杂的设备设计
方便集成传感单元和反馈控制	有时需要特殊设计
减少了合成时间

空间分离

在微流控的流动体系中，成核、生长和形成过程可以在空间上分离，从而发生在不同的地方；而在传统方法合成中，这些步骤同时发生在反应釜中。在传统合成反应中，由于缺乏颗粒的充分混合和分离，团聚的发生几乎不可避免，导致合成除的颗粒的尺寸和形状更不均一。在微流控装置中将各个反应步骤在空间上分离的另一个优势是，装置的每个部分都可以优化设计成适于那里发生反应的条件，从而有利于实现高反应率和放大生产。

对反应参数的微调

在微流控系统中，可以方便地控制温度、pH、试剂浓度和流速等各种实验参数并进行微调，以合成期望特性的纳米颗粒。由于微流控器件的尺寸较小，可以快速改变温度等反应条件。灵活快速的改变反应参数可以更好地控制反应，并可以快速筛选并找到*佳的反应条件。微流控器件也为传感器集成和实时反馈，从而完成过程优化和在线表征提供了新的可能。

常用的微流控混合器

被动和主动混合是微流控装置中纳米颗粒形成的关键步骤。由于大多数微流控装置中液体流动都呈层流，混合主要靠层流之间的扩散。连续微流控通道中的样品的混合时间可用以下公式近似计算：

其中w是通道宽度，D是中心流中溶剂的扩散率，R是中心流速与周围流的流速之比。因此，混合时间可以通过适当的芯片设计和控制流速来控制。为了提高混合性能，单相系统通常由T形、Y形、同轴管、流动聚焦、鱼骨形混合器和微混合反应器等结构组成。其中一些混合技术如图4所示。

图3。常用微流控混合技术(a)Y型微流控装置。T形微流控装置。(c)流动聚焦装置(d)鱼骨形微混合器。

微流体系统作为高度可控的纳米颗粒的平台，已显示出巨大的潜力。 应用微流控技术合成的纳米颗粒质量更高，有望加速纳米颗粒在生物医学应用中的研究。 微流体合成纳米颗粒的挑战在于如何将概念验证转化为临床和工业应用。 在应用的过程中，还必须解决制造、自动化和通道堵塞方面的挑战。 尽管如此，微流体技术在解决当前的一些技术挑战，大规模、高性价比的纳米颗粒合成的发展方面仍具有巨大的潜力和广阔的前途。

 

友情备注：

FluidicLab提供标准的流动聚焦和鱼骨形微混合器，并提供完整的流体控制方案。如有需要，敬请垂询。