实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)缩略图

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)

实验目的:

参照Moderna和BioNtech的新冠疫苗配方,以MC3和SM102为主要脂质,制备包载mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)。

实验原理:

MC3和SM102是两种可解离脂质,在酸性条件下可质子化形成阳离子脂质,通过静电作用于带负电的mRNA结合,形成载有mRNA的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNPs)。在本实验中采用微流控混合法,让脂质溶液与和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的形成粒径均一的LNP。由于脂质溶解于乙醇中,核酸溶解于酸性缓冲液中,因此需要透析或者超滤去除残余的乙醇并将溶液体系置换至PBS中。

实验材料:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图
实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图1

实验步骤:

1.配制脂质-乙醇溶液:

LNP 的成分与分子量见下表:

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百分比来源于前期研究,并不一定与onpattro和mRNA-1273相同。

每种成分别配置三个浓度:8 mM(约5 mg/ml)、12 mM(约7.5 mg/ml)和16 mM(约10 mg/ml)。

2.计算mRNA浓度:

根据N/P=6,FRR=3计算所需RNA浓度。

RNA的碱基的平均分子量为340,每个碱基携带1个磷酸,因此RNA中的含磷量为3.1 nmol/μg.

计算氮磷比时仅计算主要脂质中的氮原子数,因此每摩尔混合脂质中含有0.5摩尔N。

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图3
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3.配制mRNA-柠檬酸缓冲液:

使用超纯水分别配制100 mM的柠檬酸(分子量:210.14,称取1.05 g)和柠檬酸钠(分子量:294.10,称取1.47 g)溶液各50 ml。

取33.0 ml柠檬酸溶液和17.0 ml柠檬酸钠溶液,混合后加入DEPC,静置30分钟后高压灭菌去除DEPC,灭菌后使用DEPC水定容至100 ml即得50 mM pH=4的柠檬酸缓冲液。

将mRNA测定浓度后根据脂质浓度使用柠檬酸缓冲液稀释至所需浓度。

4.微流控混合:

一、装配微流控混合芯片和夹具:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图5
如图1所示,打开夹具。
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如图2所示,取出夹具中的空白玻璃。
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如图3所示,装入LNP混合芯片,注意玻璃面向上,芯片要完全陷入到卡槽中,否则芯片很容易被夹具压碎。
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如图4所示,合上卡扣,芯片装载完成。
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如图5所示,将磷脂溶液和mRNA溶液导入,即可制作LNP。
实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图10
如图6所示,将夹具放置在托盘上,托盘下放置废液管和样品收集管。

二、预冲洗管路和微混合芯片:

预冲洗保证微混合芯片内部已经预先充满乙醇和柠檬酸缓冲液。

1. 将无水乙醇和柠檬酸缓冲液通过0.22微米微孔滤膜过滤。

2.将无水乙醇吸入1 ml注射器中(吸入体积约0.7 ml),将柠檬酸缓冲液吸入3 ml注射器中(吸入体积约2.1 ml),并排出注射器中的空气。在注射器上标注“乙醇”和“缓冲液”。

3.分别将“乙醇”和“缓冲液”注射器和样品导入管连接,并安装在注射泵上,如下图所示。

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图11

组装完成的注射泵和芯片夹具如图所示:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图12

4.按照以下步骤选择合适的注射器型号,注射体积和流速(以LNP-B0为例,总流速2.4ml/min)。

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  1. 将废液管放置在样品流出管下,收集流出的废液。
  2. 点击开始,开始冲洗管路和芯片。
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三、微流控混合制备LNP:

1.分别将分别将脂质-乙醇溶液和mRNA-柠檬酸缓冲液通过0.22微米滤膜过滤。

2.将脂质-乙醇溶液吸入1 ml注射器中(根据需要,至少需要吸入0.5 ml),将mRNA-柠檬酸缓冲液吸入3 ml注射器中(至少吸入1.5 ml),并排出注射器中的空气。

3.将注射器出口和样品导入管连接,并固定在注射泵上。

4.用户可根据具体需要来调整注射泵的流速和混合体积。推荐起始设定如下:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图15

5.点击运行,观察流出管流速稳定后(一般需要丢弃前200微升液体),用收集管收集流出的液体。一般在注射结束前1-2秒停止收集,丢弃最后1-2秒流出的液体(若配备自动切换前后废的装置,则需要在软件中设置)。

 

四、透析(或者超滤)与储存:

透析:

1.样品收集后,立即用30倍体积的PBS将乙醇浓度稀释到1%以下。

2.使用动态光散射仪测定LNP粒径和均一度。正常结果如下图所示:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图16

3.制备后放入透析管(Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL)中加入14 ml PBS在摇床上透析,2小时后换液,直至18小时后透析结束。一般透析或者超滤后粒径和PDI均会略微增大。正常结果如下图所示:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图17

4.保存于含有2%蔗糖的PBS,-80℃冻存。

超滤:

1.样品收集后,立即用30倍体积的PBS将乙醇浓度稀释到1%以下。

2.使用Milipore 30 KD超滤管,3000 g离心20分钟进行超滤。

3.保存于含有2%蔗糖的PBS,-80℃冻存。

实验名称:LNP包封率测定

实验目的:

对制备的LNP包封mRNA的效果进行测定。

实验原理:

Quant-iT™RiboGreen®RNA试剂是一种超灵敏的荧光核酸染色剂,可检测溶液中1-200 ng的核酸,这种核酸染料无法透过LNP,因此只有游离的未被LNP包载的核酸可以被结合。Triton-100作为一种表面活性剂常被用做破乳剂,使用1%的Triton-100处理获得的LNP-mRNA可以使包载的核酸释放,得到总核酸量。通过计算破乳前后核酸量的差异得到载药量,再除以总核酸量即可得到包封率,即:

包封率(%)=(破乳后定量-破乳前定量)/破乳后定量

实验材料:

Quant-iT™ RiboGreen™ RNA 检测试剂盒(Thermo Fisher,R11490)

Triton™ X-100  (SIGMA-ALDRICH,T8787-100ML)

DEPC水

CellCarrier-96 Ultra Microplates ( PerkinElmer,6055308)   

实验步骤:

  1. LNP制备:

见LNP制备流程。

2.试剂准备(详细参见说明书):

将20xTE用DEPC水稀释至1x;

用稀释好的1XTE稀释试剂盒中的标准品,稀释成2 μg/mL及100 ng/mL两种终浓度;

用1xTE稀释试剂盒中的QuantiT™ RiboGreen® Reagen,稀释成200倍及2000倍两种终浓度;

按照下表在CellCarrier-96 Ultra Microplates中加入以下试剂,做复孔:

High range

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Low range

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图19

3.LNP破乳

      将Triton-100用1xTE稀释到2%,取100 μl加入CellCarrier-96 Ultra Microplates,加入1 μl制备好的LNP,处理5分钟,加入100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

4.LNP游离核酸测定

在CellCarrier-96 Ultra Microplates中加入100ul1xTE,取1μl制备好的LNP加进去,混匀,加入100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

5.读板      

     使用SPARK读取荧光强度,激发光设置为480 nm,发射光为520 nm

6.数据处理

1) 标曲制备

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图20

2) 样品定量

载药量=破乳后读值-破乳前读值

包封率(%)=载药量/破乳后读值

 

实验操作视频指导

步1_连接注射泵—(实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)

 

步2_装载芯片—(实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)

 

步3_制作LNP—(实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)