微流控应用实例:高通量微液滴制备缩略图

微流控应用实例:高通量微液滴制备

液滴微流体作为一种新兴技术,可以在微纳米尺度上实现对流体的精确控制,以生成高单分散(CV)和高重复性的微液滴。基于此种技术,可以制备多种微粒:微胶囊、水凝胶微球、功能聚合物粒子和量子点微球等,从而为诊断学、制药学、化妆品和免疫层分析技术等领域提供更多的便利。

尽管液滴微流控技术具有以上如此多的优点,但其单个制备单元的产量较低,一般流量在0.1~10 mL/h,这严重阻碍了液滴微流控技术在工业化上的广泛应用。而传统乳化技术如高速搅拌、均质、超声和膜乳化等方法具有操作简单和成本低等优点,可以实现较高的产量;但其缺点也是明显的:生产粒径分布较宽(CV<30%)。

相较之下,在保证微液滴高单分散(CV<5%)下,集成上千甚至上万个微流控液滴生成单元同时运行更能满足工业应用的需求。随之而来的问题是,需要投入大量的流体泵、压力控制驱动装置及相关的基础设施,这将会大提高投资成本,且操作难度也会大大提高。因此,液滴微流控的集成放大成为了液滴微流控技术面向工业应用的技术难点。

FludicLab高通量液滴微流控平台,只需一台两通道压力控制器,一只玻璃芯片和对应夹具便完成了四路微流控液滴单元并联的高单分散性(CV=3.44%)和高通量(12 mL/h)微液滴生成。

四路微流控液滴单元并联的微液滴生成视频,油相:2%氟油,水相:墨水

微流控应用实例:高通量微液滴制备插图

显微镜下观察到的收集的微液滴

微流控应用实例:高通量微液滴制备插图1

收集到的微液滴粒径统计图

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微流控技术前沿:单细胞蛋白组学研究(章节一)缩略图

微流控技术前沿:单细胞蛋白组学研究(章节一)

➤ 1.引言

作为生命的物质基础,蛋白质参与了体内细胞的生长和黏附、免疫应答和催化等过程,是生命活动的主要承担者[1]。在内部基因和外界环境的共同作用下,蛋白质表达与否及表达量的差异将直接影响着疾病发生、神经传导和免疫应答等[2]。因此,蛋白表达分析对分子机制研究、疾病的临床诊断和治疗以及药物的开发等方面都其重要[3]。早期的蛋白组学分析方法如质谱、免疫分析和双向电泳等技术,往往需要大量的细胞,检测结果反映的是细胞群体的平均蛋白表达水平[4]。然而,拥有相同基因组信息的细胞在蛋白表型上存在显著的异质性。基于组织水平的蛋白组分析更易忽略细胞个体间的差异,而细胞的异质性在癌症转移和干细胞分化等方面起至关重要的作用[5]。随着技术的发展,更多的研究结果表明单细胞中DNA、mRNA转录和蛋白表达水平相关性较差,这严重限制了从DNA和mRNA角度来评估蛋白质组学信息的能力[6,7]。 对于一个细胞水平的生物过程,往往是由多个基因之间相互作用的结果所致。因此,单细胞水平上的蛋白表达研究更能揭示大量不能通过单个基因或组织水平研究解释的现象,是理解基因组与细胞反应之间的重要桥梁。单细胞蛋白组分析能够从大量细胞中区分和识别那些罕见但重要的细胞,有助于临床诊断、药物研发和某些重要的分子机制的研究[5]。与基因表达分析相比,测定单细胞中蛋白组的难点在于蛋白质种类复杂,且含量非常低,蛋白质无法像DNA和RNA那样能以快的速度实现扩增[7,8]。因此,单细胞蛋白组分析应当具备多重分析性能、高吞吐量和高灵敏度等特点[9]。在这其中,多重分析性能决定了单细胞蛋白组中的蛋白数量,吞吐量决定了并行分析的细胞数量,灵敏度决定了检测分析样本的浓度下限[4]。而在这方面,基于质谱的无抗体标记技术有望解决单细胞蛋白组学面临的以上问题。近有文献报道指出,采用新兴的单细胞蛋白组学质谱技术(SCoPE-MS)及其第二代(SCoPE2)技术可以实现对数百个单细胞样本中数千个蛋白进行定量分析[10]。然而,单细胞蛋白组学仍存在一些问题,如单细胞样本与设备连接困难,样本处理需精度高(样本微小损失会严重影响检测结果),需同时对大量单细胞进行分析以减少固有噪声等[11,12]。以上这些问题无法通过简单的修改传统的基于单细胞蛋白组分析的方法和常规样品处理技术很难解决。 微流控是一种对微纳米尺度上的流体进行控制新兴技术[13]。微流控芯片中流道微米级尺寸恰好与细胞匹配,这使得微流控成为单细胞分析(包括单细胞蛋白组分析)的理想平台[14]。微流控技术本身虽不是一种分析手段,但它能有效避免样品过度稀释(降低检测限),显著提高了样品吞吐性能(以便获得足够数据进行重要统计),并大幅度降低了成本,是一种有效的单细胞蛋白组学分析方法[15, 16]。近年来,基于微流控的各种不同单细胞蛋白组学分析方法不断被报道,且部分方法已实现商业化。因此,本文将着重对新报道的方法、及应用和优缺点进行系统的阐述,并对目前的商业发展进行简要回顾。

➤  2.基于微流控技术的单细胞分析方法

2.1 单细胞条码芯片 为了对单细胞蛋白组进行全面的分析,Ma等开发了一种基于阀门控制的PDMS单细胞条码芯片(single-cell barcode chip, SCBC)[17]。此芯片由一张装有13组垂直阀门的PDMS层、一张含有80组水平的微通道(横截面尺寸为100 µm × 17 µm) PDMS层和一张具有条码阵列的玻璃基底三部分自上而下组装而成(图1A-a)。通过将上层和中层的两个PDMS层交错以形成1040个微室用于载入单个细胞。下层玻璃基底上的条码阵列是一条条平行条带,每一条带首先利用DNA编码抗体文库(DNA-encoded antibody library, DEAL)法[18]结合特异性抗体,即分别将不同序列的单链DNA分子固定在不同条带上(条带表面有聚胺涂层),再利且碱基对互补作用连接上偶联了抗体的另一条单链DNA分子,这一作法避免了抗体直接连接降解的问题;然后,利用控制阀门将细胞随机载入一千多个微室中,每个微室载入的细胞个数从零到几个不等,其细胞载入数量符合泊松分布(图1A-b);分散于各个微室中的单细胞分泌的蛋白继而由微室内特定DNA编码的抗体库所捕获;随后,捕获的蛋白会通过三明治法进行荧光免疫分析测定,也即是捕获的蛋白与生物素标记的抗体结合,再利用链霉亲和素进行荧光标记,终通过荧光强度对蛋白组进行检测分析(图1A-c)。结果表明,这种方法具有高的样品效率和高的灵敏度,能同时定量检测十多种单细胞分泌蛋白组,并提示了表型相似T淋巴细胞的高度功能异性。在此基础上,该方法经过改进被用于各种单细胞分泌蛋白的定量研究,如人类肿瘤细胞系[19]和原代细胞[20]。为了进一步提高单细胞蛋白组多重分析性,Lu等将空间和光谱编码与PDMS微腔相结合,能实现同时对单细胞分泌的42种免疫效应蛋白进行检测[21]。此外,也有报道利用SCBC芯片用于单细胞分泌蛋白对细胞间相互作用以及信号转导影响的研究[22,23]。 除了单细胞分泌蛋白组分析外,Wang等将该法扩展到基于无阀控制的SCBC来分析检测单细胞(包括膜蛋白、细胞内和分泌蛋白),以此量化细胞间相互作用[24](图1B)。此芯片由一张含有8700个微室的PDMS层和一张具有高密度条码阵列的玻璃基底组成。上层PDMS层的8700个微室共被分成435组(20个/组),在每组的中间位置有一条贯穿的微通道,微通道两侧各分布10个微室(图1B-a)。PDMS层与具有条码阵列的玻璃基底键合时主要是通过可压缩变形(利用压力改变)的微柱接触。如图1B-b所示,在无压力状态(Fully open)下,向SCBC中通入足够数量的细胞以确保每个微室随机载入0~3个细胞;载入细胞后调整压力使微柱变形收缩至Close state II以此封装细胞于微室内培养;经培养一段时间,期间单细胞分泌蛋白被特定的抗体阵列所捕获(图1B-c)。而关于细胞质或膜蛋白组分析,首先施加压力使微柱处于Close state I,在微通道内通入裂解缓冲液裂解细胞,而裂解缓冲液会被引入微室内(此时状态细胞无法移动到微室外);细胞裂解后的细胞质或膜蛋白组同样被特定的抗体阵列所捕获,然后通过荧光免疫分析对蛋白组进行测定(图1B-c)。结果表明,在一定培养时间内,细胞在短距离时会产生抑制作用,在较大距离时主要产生激活作用。
微流控技术前沿:单细胞蛋白组学研究(章节一)插图

图1  |  A、用于单细胞分泌蛋白组分析的SCBC设计图:a. SCBC装置图,b. 微室放大图(图中数字代表微室中细胞数),c. DEAL法捕获分泌蛋白进行免疫测定;B、用于单细胞综合蛋白组分析的SCBC设计图:a. 无阀控制的SCBC装置图,b. 单细胞分析流程图,DEAL法捕获分泌蛋白、细胞质蛋白或膜蛋白进行免疫测定,c. DEAL法捕获蛋白进行免疫测定,d. 微室放大图,e. SCBC对分泌(IL6)和细胞质(p-Erk)蛋白的荧光数据。‍

此外,有关罕见细胞纯化以及蛋白组学分析也有报道。如Shi课题组设计开发了一种结合SCBC集成的微流控系统应用于罕见单循环肿瘤细胞(CTCs)纯化及分泌蛋白组学分析研究[25]。CTC分离纯化和单细胞蛋白组分析的整个系统主要包括:CTC捕获芯片(包括紫外灯)、红细胞(RBC)捕获芯片、白细胞(WBC)捕获芯片和SCBC芯片(图2A)。其原理如图2B所示,将含有单链ssDNA编码特异性抗体(含有光解连接物)标记的CTC全血样本通入CTC捕获芯片中,而CTC表面的单链ssDNA会与芯片上固定的单链ssDNA互补而被捕获;待细胞被捕获后,将CD45(普通白细胞抗原)和CD15(粒细胞标记物)包被的免疫磁珠的混合物通入芯片中,并与非特异性结合的白细胞结合;随后将芯片暴露在紫外灯下短时间暴露以将释放固定在芯片中的CTC;接着将其流入到RBC捕获芯片即螺旋芯片中,通过调控流速(控制离心率)以除去RBC;然后将其流入到WBC捕获芯片,利用磁铁除去与磁珠结合的WBC;后,将高纯度的CTC流入到SCBC芯片,以便使得集成的聚赖氨酸(PLL)条形码对单个CTC进行捕获来完成分泌蛋白组学分析研究。在这其中,合成可光降解的单链ssDNA编码特异性抗体是为了在不损害细胞活力下高效捕获和释放CTC。结果表明,这种结合SCBC芯片集合的微流控系统有效的实现了对CTC的分离和纯化,且CTC表现出高度的异质性。
微流控技术前沿:单细胞蛋白组学研究(章节一)插图1

图2  |  A、实验装置和微流控芯片;B、CTC分离纯化和单细胞分泌蛋白分析的示意图。‍

采用SCBC分析具有样本量小、灵敏度高、范围广(包括膜蛋白、胞内和分泌蛋白)和多重分析能力等优点。尽管如此,但它仍有一些问题需要改进。如芯片的微阀制造复杂,操作复杂,有限的条码微芯片面积限制了其检测的吞吐量等。此外,多重分析能力与检测灵敏度之间需保持平衡,即多重分析能力越大反而会导致分析灵敏度的降低。 2.2 液滴微流控技术 采用液滴微流控技术可将单个细胞封装在小的液滴内以分离和研究细胞表面膜蛋白组及其分泌蛋白组。与其他方法不同的是,单细胞被封装在悬浮于油相中的液滴中,细胞空间的隔离有效避免了蛋白组的扩散[26]。此外,水相确保了培养细胞的正常生理条件,而常用的氟油由于具有较高溶氧量则更利于细胞的培养[27]。因此,基于液滴的微流控技术在单细胞蛋白组学分析的报道层出不穷。图片
微流控技术前沿:单细胞蛋白组学研究(章节一)插图3
图3  |  A、利用测序对转录组和表位进行细胞索引(CITE-seq);B、RNA表达和蛋白测序分析(REAP-seq)[28], R1: read 1. R2: read 2。 Stoeckius等人介绍了一种基于液滴微流控技术,通过测序对转录组和表位进行细胞索引(cell indexing of transcriptomes and epitopes by sequencing, CITE-seq)的方法[29]。其操作流程如图3A所示,首先利用生物素和链霉亲和素将特异性抗体与寡核苷酸链(包括PCR handle、Ab barcode和捕获DNA序列,其中Ab为抗体,捕获序列能和beads上的序列互补配对)连接;随后,利用传统的流式细胞术用DNA标记的特异性抗体对细胞进行免疫染色;然后采用液滴微流控技术将单细胞、带有条形码的beads及试剂共同封装在液滴中;通过细胞裂解并还原二硫键将寡核苷酸链与特异性抗体断开,细胞中的mRNA序列和标记特异性抗体的DNA序列与beads上的条形码互补配对;随后,mRNA序列和标记特异性抗体的DNA序列利用逆转录同时通过延伸杂交形成互补链;然后,通过PCR扩增对转录组和蛋白组衍生物进行分离以确保文库的相对比例可分别调整;后,对这两个文库进行测序,并在分析过程中对单细胞蛋白组学和转录组学数据进行分组研究。同年,Peterson等人也提出了RNA表达和蛋白测序分析(RNA expression and protein sequencing, REAP-seq)(图3B所示)[30]。这种方法与CITE-seq非常相似,但两者的不同点在于寡核苷酸与抗体结合方式由胺类代替原来的生物素和链霉亲和素。这一区别也决定了寡核苷酸与抗体是否能断开。以上这两种技术都适用于单细胞转录组分析的所有液滴微流控技术,然而,其局限性在于只能对细胞表面膜蛋白组进行测定分析。
微流控技术前沿:单细胞蛋白组学研究(章节一)插图4
图4  |  Abseq[28], R1: read 1. R2: read 2.
除此之外,Abate 课题组也设计出了Abseq[31]。这种方法与CITE-seq和REAP-seq相比有些许相同之处,如:用捕获DNA序列标记抗体,且在微流控封装之前用经DNA序列标记的抗体免疫染色细胞,随后对扩增的文库进行测序和数据分析。然而,此法也有不少差异。具体如下:在Abseq中,液滴微流控处理总共三个操作过程(即三个芯片)。首先,利用微流控芯片分别生成两种液滴:一种是单细胞液滴,另一种是条形码引物液滴;其中,单细胞液滴封装DNA标记抗体(利用异双功能交联剂将抗体和寡核苷酸链,寡核苷酸链是由PCR handle、UMI、抗体条码和捕获序列组成)免疫染色的细胞和蛋白酶(用于细胞裂解),条形码引物液滴封装一个DNA序列、PCR试剂及引物混合物,然后通过PCR扩增以实现条形码扩增(每个条形码包含细胞条形码和捕获序列组成);然后,在第三个芯片中生成含有PCR扩增的液滴并与前两个芯片产生的液滴按1:1:1的数量混合;在其混合后每个液滴(非常大且不稳定)被分成四个相等的液滴以进行热循环和PCR扩增;Abseq的优点是在于蛋白酶K裂解细胞后使其失活以免后续细胞裂解物抑制PCR反应。这种方法只适用于单细胞表面膜蛋白组分析,而不适用于mRNA分析。 液滴微流控技术具有独特的优势,一方面可以将单细胞限制在液滴内通过测序的方式对细胞表面膜蛋白组进行分析,另一方面也可以基于荧光液滴微流控技术对单细胞分泌蛋白进行测量以此降低成本。迄今为止,已开发了许多基于荧光的液滴微流控技术用于单细胞分泌蛋白组的工具。通常情况下,将单细胞与捕获结构共同封装在液滴中进行细胞培养,细胞分泌的蛋白后会被捕获结构所捕获[5]。捕获结构一般分为两部分:一部分(特异性抗体或适配体)用于与细胞分泌蛋白特异性结合,另一部分被固定在载体上(如珠子、细胞表面)。 Qiu等人通过直接在细胞膜表面锚定适配体用于捕获细胞分泌蛋白,其优点是所有的操作都是在液滴中进行的,从而能随着时间变化监测细胞分泌蛋白的产生[32](图5A所示)。其原理如下:首先,通过胆固醇将配体探针与细胞表面的磷脂层连接,而适配体探针两端分别用荧光团和猝灭剂标记;随后,通过液滴微流控技术将带有配体的细胞封装在液滴内。在没有细胞分泌蛋白存在下,配体自杂交形成发夹结构,使荧光团和猝灭剂保持在很近的距离,从而导致荧光的猝灭;当捕获细胞分泌蛋白时,适配体探针转变为一种特定的三级结构,荧光团和猝灭剂被分开,从而导致荧光信号的增强。 Wimmers等人利用锚定在细胞表面的双功能结构抗体捕获细胞分泌蛋白[33](图5B所示)。在这种情况下,利用液滴微流控技术将锚定抗体的细胞与相应试剂封装,经培养后,细胞产生的分泌蛋白被细胞表面锚定的双功能结构抗体捕获;待破乳后,引入的荧光标记抗体会与细胞表面所捕获的分泌蛋白结合完成分析检测。 此外,也有文献报道通过将捕获细胞分泌蛋白的抗体固定在聚苯乙烯珠上完成分泌蛋白的捕获和分析检测[34]。具体操作如图5C所示,首先,利用液滴微流控技术将单细胞和分泌蛋白捕获珠共同封装在单分散的琼脂糖液滴中;经封装和孵育,细胞分泌蛋白与聚苯乙烯捕获珠上的抗体结合,并实现琼脂糖液滴的固化;破乳后,获得的琼脂糖珠用荧光标记的抗体染色并通过流式细胞术检测分泌蛋白。
微流控技术前沿:单细胞蛋白组学研究(章节一)插图5
图5  |  基于液滴微流控技术用于单细胞蛋白组的分析研究。A、细胞膜锚定适配体探针用于捕获分泌蛋白;B、细胞膜锚定抗体用于捕获分泌蛋白;C、抗体标记的捕获珠用于捕获分泌蛋白[28] 基于液滴微流控技术用于分泌抗体的免疫细胞研究也有较多报道。如Mazutis等利用捕获珠表面的荧光信号对抗体分泌细胞进行分类[35]。具体流程如图6A所示,首先将单细胞、涂有Anti-IgG抗体的捕获珠和荧光标记的探针一起封装在液滴中;经芯片外培养后,细胞分泌感兴趣的抗体与被捕获珠所捕获;随后,荧光标记的探针与捕获的抗体结合从而定位在捕获珠表面;后,将乳液重新注入芯片中,并通过捕获珠上局部荧光信号用于高通量筛选抗体分泌细胞。 Eyer等人通过DropMap (droplet-based microfluidic technology)研究单细胞分泌抗体结合特定抗原随时间的变化(图6B所示)。其原理如下:将单细胞、1300个涂有捕获分子的磁纳米颗粒、荧光标记的检测抗体与荧光标记的抗原一起包封在液滴内。随后,将液滴固定在观察室中,在磁力的作用下形成2D液滴阵列结构,并用荧光显微镜进行成像观察;单细胞分泌的抗体与捕获珠结合,并通过与荧光标记的检测抗体结合来显现;此时,施加的磁场会在每个液滴中诱导形成细长、容易观察的纳米颗粒聚集体即珠线;单细胞抗体分泌率可通过标记抗体的荧光强度来观察,而抗体对抗原的亲和力则通过标记抗原的荧光强度来测定。图片
微流控技术前沿:单细胞蛋白组学研究(章节一)插图6
图6  |  不同液滴微流控技术在单细胞分泌抗体上的应用有研究。A、 分泌抗体细胞的筛选,B、采用DropMap用于抗体分泌和抗体对特异性抗原的亲和性研究[28]
实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)缩略图

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)

实验目的:

参照Moderna和BioNtech的新冠疫苗配方,以MC3和SM102为主要脂质,制备包载mRNA的脂质纳米颗粒(LNP)。

实验原理:

MC3和SM102是两种可解离脂质,在酸性条件下可质子化形成阳离子脂质,通过静电作用于带负电的mRNA结合,形成载有mRNA的脂质纳米颗粒(lipid nanoparticles, LNPs)。在本实验中采用微流控混合法,让脂质溶液与和mRNA溶液在微混合器中充分、迅速的形成粒径均一的LNP。由于脂质溶解于乙醇中,核酸溶解于酸性缓冲液中,因此需要透析或者超滤去除残余的乙醇并将溶液体系置换至PBS中。

实验材料:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图
实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图1

实验步骤:

1.配制脂质-乙醇溶液:

LNP 的成分与分子量见下表:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图2
百分比来源于前期研究,并不一定与onpattro和mRNA-1273相同。

每种成分别配置三个浓度:8 mM(约5 mg/ml)、12 mM(约7.5 mg/ml)和16 mM(约10 mg/ml)。

2.计算mRNA浓度:

根据N/P=6,FRR=3计算所需RNA浓度。

RNA的碱基的平均分子量为340,每个碱基携带1个磷酸,因此RNA中的含磷量为3.1 nmol/μg.

计算氮磷比时仅计算主要脂质中的氮原子数,因此每摩尔混合脂质中含有0.5摩尔N。

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图3
实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图4

3.配制mRNA-柠檬酸缓冲液:

使用超纯水分别配制100 mM的柠檬酸(分子量:210.14,称取1.05 g)和柠檬酸钠(分子量:294.10,称取1.47 g)溶液各50 ml。

取33.0 ml柠檬酸溶液和17.0 ml柠檬酸钠溶液,混合后加入DEPC,静置30分钟后高压灭菌去除DEPC,灭菌后使用DEPC水定容至100 ml即得50 mM pH=4的柠檬酸缓冲液。

将mRNA测定浓度后根据脂质浓度使用柠檬酸缓冲液稀释至所需浓度。

4.微流控混合:

一、装配微流控混合芯片和夹具:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图5
如图1所示,打开夹具。
实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图6
如图2所示,取出夹具中的空白玻璃。
实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图7
如图3所示,装入LNP混合芯片,注意玻璃面向上,芯片要完全陷入到卡槽中,否则芯片很容易被夹具压碎。
实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图8
如图4所示,合上卡扣,芯片装载完成。
实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图9
如图5所示,将磷脂溶液和mRNA溶液导入,即可制作LNP。
实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图10
如图6所示,将夹具放置在托盘上,托盘下放置废液管和样品收集管。

二、预冲洗管路和微混合芯片:

预冲洗保证微混合芯片内部已经预先充满乙醇和柠檬酸缓冲液。

1. 将无水乙醇和柠檬酸缓冲液通过0.22微米微孔滤膜过滤。

2.将无水乙醇吸入1 ml注射器中(吸入体积约0.7 ml),将柠檬酸缓冲液吸入3 ml注射器中(吸入体积约2.1 ml),并排出注射器中的空气。在注射器上标注“乙醇”和“缓冲液”。

3.分别将“乙醇”和“缓冲液”注射器和样品导入管连接,并安装在注射泵上,如下图所示。

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图11

组装完成的注射泵和芯片夹具如图所示:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图12

4.按照以下步骤选择合适的注射器型号,注射体积和流速(以LNP-B0为例,总流速2.4ml/min)。

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图13
  1. 将废液管放置在样品流出管下,收集流出的废液。
  2. 点击开始,开始冲洗管路和芯片。
实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图14

三、微流控混合制备LNP:

1.分别将分别将脂质-乙醇溶液和mRNA-柠檬酸缓冲液通过0.22微米滤膜过滤。

2.将脂质-乙醇溶液吸入1 ml注射器中(根据需要,至少需要吸入0.5 ml),将mRNA-柠檬酸缓冲液吸入3 ml注射器中(至少吸入1.5 ml),并排出注射器中的空气。

3.将注射器出口和样品导入管连接,并固定在注射泵上。

4.用户可根据具体需要来调整注射泵的流速和混合体积。推荐起始设定如下:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图15

5.点击运行,观察流出管流速稳定后(一般需要丢弃前200微升液体),用收集管收集流出的液体。一般在注射结束前1-2秒停止收集,丢弃后1-2秒流出的液体(若配备自动切换前后废的装置,则需要在软件中设置)。

 

四、透析(或者超滤)与储存:

透析:

1.样品收集后,立即用30倍体积的PBS将乙醇浓度稀释到1%以下。

2.使用动态光散射仪测定LNP粒径和均一度。正常结果如下图所示:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图16

3.制备后放入透析管(Slide-A-Lyzer™ MINI Dialysis Device, 10K MWCO, 0.5 mL)中加入14 ml PBS在摇床上透析,2小时后换液,直至18小时后透析结束。一般透析或者超滤后粒径和PDI均会略微增大。正常结果如下图所示:

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图17

4.保存于含有2%蔗糖的PBS,-80℃冻存。

超滤:

1.样品收集后,立即用30倍体积的PBS将乙醇浓度稀释到1%以下。

2.使用Milipore 30 KD超滤管,3000 g离心20分钟进行超滤。

3.保存于含有2%蔗糖的PBS,-80℃冻存。

实验名称:LNP包封率测定

实验目的:

对制备的LNP包封mRNA的效果进行测定。

实验原理:

Quant-iT™RiboGreen®RNA试剂是一种超灵敏的荧光核酸染色剂,可检测溶液中1-200 ng的核酸,这种核酸染料无法透过LNP,因此只有游离的未被LNP包载的核酸可以被结合。Triton-100作为一种表面活性剂常被用做破乳剂,使用1%的Triton-100处理获得的LNP-mRNA可以使包载的核酸释放,得到总核酸量。通过计算破乳前后核酸量的差异得到载药量,再除以总核酸量即可得到包封率,即:

包封率(%)=(破乳后定量-破乳前定量)/破乳后定量

实验材料:

Quant-iT™ RiboGreen™ RNA 检测试剂盒(Thermo Fisher,R11490)

Triton™ X-100  (SIGMA-ALDRICH,T8787-100ML)

DEPC水

CellCarrier-96 Ultra Microplates ( PerkinElmer,6055308)   

实验步骤:

  1. LNP制备:

见LNP制备流程。

2.试剂准备(详细参见说明书):

将20xTE用DEPC水稀释至1x;

用稀释好的1XTE稀释试剂盒中的标准品,稀释成2 μg/mL及100 ng/mL两种终浓度;

用1xTE稀释试剂盒中的QuantiT™ RiboGreen® Reagen,稀释成200倍及2000倍两种终浓度;

按照下表在CellCarrier-96 Ultra Microplates中加入以下试剂,做复孔:

High range

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图18

Low range

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图19

3.LNP破乳

      将Triton-100用1xTE稀释到2%,取100 μl加入CellCarrier-96 Ultra Microplates,加入1 μl制备好的LNP,处理5分钟,加入100 μl 200-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

4.LNP游离核酸测定

在CellCarrier-96 Ultra Microplates中加入100ul1xTE,取1μl制备好的LNP加进去,混匀,加入100 μl l2000-fold diluted quant-iT RiboGreen Reagent。

5.读板      

     使用SPARK读取荧光强度,激发光设置为480 nm,发射光为520 nm

6.数据处理

1) 标曲制备

实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)插图20

2) 样品定量

载药量=破乳后读值-破乳前读值

包封率(%)=载药量/破乳后读值

 

实验操作视频指导

步1_连接注射泵—(实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)

 

步2_装载芯片—(实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)

 

步3_制作LNP—(实验方案:微流控混合方式制备mRNA脂质纳米颗粒(LNP)

微流控技术前沿:高通量患者来源类器官培养平台,助力临床决策缩略图

微流控技术前沿:高通量患者来源类器官培养平台,助力临床决策

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患者来源类器官已成为一种有效的体外癌症研究模型。与2D细胞系、3D细胞系和原代细胞培养相比,患者来源类器官已被应用于药物筛选,以证明基因突变与靶向治疗敏感性之间的相关性。类器官也被用于联合临床试验,以比较类器官的药物反应与相应患者的临床反应。许多研究已经成功地使用类器官来预测癌症患者的治疗反应。利用微流控技术大规模的培养患者来源的类器官,显示了在高通量药物筛选和促进临床治疗决策方面的巨大前景。

微流控技术前沿:高通量患者来源类器官培养平台,助力临床决策插图

四种体外肿瘤细胞培养模型的比较。

二维细胞系:从ATCC中获得细胞后,可在10cm的培养皿中培养。

3D细胞系:从ATCC中获得细胞后,可以在低黏附96孔板中生长。

2D原代细胞:从膀胱癌肿瘤中获得原代细胞后,这些细胞可以在10厘米的培养皿中生长。经过几代后,它们失去了异质性。

类器官:从膀胱癌肿瘤中获得原代细胞后,这些细胞可以在metrigel微滴中生长为类器官。

现有的体外肿瘤模型:

二维细胞系

细胞系来源于获得致癌突变的细胞,他们主要在二维平面上生长。虽然二维细胞系已经在药物筛选上得到广泛的应用。但是,这些模型仍然有很大的局限:

1、无法模拟细胞生长的微环境,无法真实的反映细胞异质性,相邻细胞间、细胞与胞外基质复杂相互作用无法得到真实呈现。

2、虽然许多癌细胞系携带在相应癌症中发现的重要基因突变,但并不一定包含这些癌症所有的基因突变。例如,7种已建立的前列腺癌细胞系均不携带在患者中发现的SPOP突变和FOXA1突变。

3、肿瘤细胞系的基因组成在传代和不同的实验室条件下会发生显著变化。例如,之前对27株MCF7细胞系进行抗癌化合物检测时,发现他们对药物反应非常不同。

3D细胞系 

替代2D细胞系的一种方法是将细胞系三维培养形成球状体。与2D培养相比,3D细胞培养明显的改善了细胞形态、力学性能、分化和活力。细胞在3D培养中的药物代谢和分泌行为也使3D细胞团更适合药物筛选。 

虽然3D细胞培养克服了2D细胞培养中微环境的问题,但是2D细胞培养中的一些根本问题,如细胞异质性无法呈现、细胞系在传代过程中呈现出的多样性等问题均无法得到解决。

原代细胞培养

原代细胞培养提供了一种更个性化的细胞培养方式。它允许科学家使用与个体患者相同的细胞,而不是使用来源于一个患者样本的细胞来代表患有该特定疾病的所有患者。培养原代细胞包括从新鲜的病人组织中获取细胞并进行体外增殖,但是培养原代细胞仍存在许多困难。

1、许多细胞在培养后不久就停止生长。

2、在多次传代后,分裂速度快慢不同的细胞发生了明显的基因表达分化。

3、多次传代后,细胞种群的比例发生了明显的变化。

患者来源的类器官(PDOs)

PDOs拥有3D细胞系、原代细胞系的优点,又克服了各自的局限,是目前有前景的细胞培养技术。

简单地说,培养PDOs首先将病人组织粉碎,并将回收的细胞置入基质胶或ECM中,体外培养使PDOs持续生长,终生长为被称为“类器官”的球体。生长良好的类器官保留了原始肿瘤的遗传图谱和组织学特性。PDOs具有巨大的优势:

 1. 肿瘤类器官可以从常规癌症活检获得的组织培养,成功率高,使其可以探索肿瘤发生不同阶段的变化。

 2. 基因表达谱在PDOs中往往保持更稳定。

 3. PDOs具有高度的可重复性。研究表明在大多数情况下,PDOs表现了对特定药物的同质反应。 

4. 肿瘤类器官也可以冷冻保存、扩增、基因分析和迅速进行药物处理。

PDOs用于指导临床治疗

在癌症治疗中,都会在手术切除肿瘤前后都使用药物进行辅助治疗。这些药物主要用于化疗、靶向治疗、放疗,以及近年来的免疫治疗。不同患者有不同的基因背景和体内环境,这可能会影响他们对某些药物的反应。因此,需要一个个性化的模型系统中测试这些药物。 

通过研究PDOs和患者对相同药物反应的的相关性,可以检测PDOs在治疗方案选择中的有效性。 

临床通过比较胃食管癌患者和来源于患者的类器官对紫杉醇的耐药性,证明了两者之间具有高度的相关性。另一项关于12名患者和患者来源类器官的研究显示,患者对tamoxifen的体内反应与乳腺癌类器官体外反应呈正相关。

 2019年的一个临床病例也显示了PDOs在指导肿瘤化疗方案中的有效性。一个结直肠癌转移患者初接受了联合药物化疗方案,包括药物5-FU、leucovorin和奥沙利铂。不幸的是,化疗完成4个月后肿瘤继续进展。为了决定是否坚持该治疗方案,首先用肝转移活检组织培养出类器官,然后使用药物来处理,并分析了类器官直径和氧化还原比,结果支持继续使用该化疗方案。后续的治疗效果也证明该化疗方案确实减少了肝转移肿瘤的体积。 

另外一项临床研究表明,患者和PDOs对放疗的敏感性高度相关,在一个80个病患样本的研究中,68个PDOs显示了和患者相同的反应。

微流控高通量患者来源类器官(PDO)培养方案

本文介绍的方法主要参考以下文献:

* “Automated microfluidic platform for dynamic and combinatorial drug screening of tumor organoids”

微流控技术前沿:高通量患者来源类器官培养平台,助力临床决策插图1
为了高通量的筛选化疗方案,并尽可能的培养更多患者的类器官,文中设计了一个巧妙的3D细胞培养腔,并配备了全自动的液路切换装置。
微流控技术前沿:高通量患者来源类器官培养平台,助力临床决策插图2
3D细胞培养腔的详细图纸,其中横排为同一个病人来源的类器官,竖排为不同的药物处理方案。
微流控技术前沿:高通量患者来源类器官培养平台,助力临床决策插图3
通过液路切换装置的自动切换,可以控制施加给肿瘤类器官的药物顺序和时间,来考察不同的化疗方案。
微流控技术前沿:高通量患者来源类器官培养平台,助力临床决策插图4
通过显微镜的实时观察,我们可以得知药物处理后肿瘤类器官的代谢和存活状况。

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微流控技术应用:三分钟完成微气泡生成缩略图

微流控技术应用:三分钟完成微气泡生成

微流控技术制备微气泡

由于气体的可压缩性,使得微气泡在超声成像造影和药物输送方面有着广泛的用途,越来越受到各行业的关注。微气泡作为超声造影初是为了改善超声信号,增加组织边界和特征的描绘。它是基于气体的可压缩性使得微气泡比周围的血液和组织更有效地散射超声能量,从而使其成为血管成像的有效探针。早在1968年,Gramiak等通过研究发现在心导管注射生理盐水时,随着注射所产生的微气泡使得在主动脉中观察到造影现象。尽管在二十年前,微气泡作为药物输送的载体在临床应用上还很概念化,但目前正在进行的一些研究已经取得了明显的进展,如作为基因的载体用于基因治疗、作为给药载体将药物送到指定区域等,这表明在不久的将来微气泡很有可能应用于临床。

理想的微气泡具有高稳定性和高单分散性。前者主要取决于其外壳成分,外壳中含有高浓度的表面活性剂,可以在微气泡表面形成类似固化的粘结剂,以此减缓气泡与气泡间的融合。然而,后者实现高单分散的微气泡仍是一个挑战。当前主要采用超声或机械搅拌方法产生微气泡,这类方法虽具有简单、方便和成本低等优势,但是产生的微气泡大小均一性差。由于超声成像造影和药物输送受共振频率影响,而共振频率范围的选择又取决于直径大小,所以生成粒径均匀的微气泡很有必要。

为了提高微气泡的均匀性,其他各种方法也被相继报道。其中基于微流控方法制备出平均直径 <10 μm的单分散气泡悬浮液是有力的方法之一。因此,在这里我们通过FluidicLab微气泡平台提供的微气泡生成芯片和对应夹具,用户只要简单的连接管路,三分钟内即可完成微气泡的生成。

微流控技术应用:五分钟完成双乳化微滴缩略图

微流控技术应用:五分钟完成双乳化微滴

双乳化微滴制备

双乳液滴是化妆品、制药或食品工业非常有前途的材料。双重乳滴可用于封装比较敏感的化合物(药物、维生素、香料……),保护活性物质,并终根据需要在合适的时间和地点释放封装的化合物。

双乳液滴的获得非常复杂。借助微流体技术可以高效稳定的生成双乳微滴。目前常用的生成微滴的结构为以下三种:co-flow,T-junction,flow focus。这三种结构均可用于双乳液液滴的形成。生成双乳液滴简单的几何形状是连续的两个流动聚焦结构。在第一个流动聚焦处形成的液滴在第二个流动聚焦处被封装到外部液滴中。

通常,双乳液是用含两种性质不同的表面活性剂的分散相分两步制备的。例如,要形成水包油包水乳液,首先将水用含有疏水性表面活性剂的油相乳化,然后在第二步中用含有亲水性表面活性剂的水相重新乳化。

使用玻璃毛细管可有效产生双乳液液滴,但组装起来比较困难,重复性较差。比较稳定可靠的方法是使用局部改性的微流控芯片来进行。

FluidicLab双乳化微滴平台提供已经进行局部改性的双乳化微滴生成芯片和对应夹具,用户只要简单的连接管路,五分钟内即可完成双乳微滴的生成。

利用微流控技术生产微气泡缩略图

利用微流控技术生产微气泡

微气泡是超声成像常用的造影剂。由于血细胞对超声波散射微弱,导致超声图像对比度很差。为了解决这一问题,微气泡造影剂被开发出来增强声学信号。

为了提高超声成像的对比度和治疗效果,必须严格控制微气泡的大小和表面特性。一个理想的微气泡必须大小均一、不随时间变化。

目前商用的超声造影剂大多由直径小于10 μm的微气泡组成。95%至98%商用的微气泡直径小于5 μm,直径标准差在0.35-0.47 μm之间,浓度一般为108到1010个/毫升。商品化的微气泡通常用磷脂或蛋白质来稳定气液界面,内部通常充满全氟碳气体,如八氟丙烷或六氟化硫,以提高稳定性。

目前常用的产生微气泡的方法是超声和机械搅拌,这两种方法虽然简单和便宜,但是产生的气泡大小均一性很差,而生成高度均一的微气泡正是微流控技术的优势所在。

1、如何使用微流控技术制作微气泡

目前制作微气泡成熟的微流控结构仍然是流动聚焦结构,如图1所示。

利用微流控技术生产微气泡插图

图1、经典的流动聚焦结构。中间相为气体相。上下两相为连续液体相。

在产生直径小于10 μm微气泡的微流控结构中,流动聚焦结构是目前应用广泛的。流动聚焦结构由两侧面的连续相和中间的气体相组成,在V形喷口处气体被连续相的液体剪切产生微气泡,出口通道角度或通道高度(14 μm到28 μm)的变化不影响气泡形成。通过增加连续相流速,降低气体流速与连续相流速的比率,可以产生直径很小的微气泡。

2、如何改变微气泡的大小

在使用流动聚焦结构时,除了气体相和连续相的流速比例外,连续相的粘度也会影响所产生的微气泡的大小,粘度的降低会生成更大的气泡。稳定的微气泡直径通常小于通道的高度,但大于喷口的直径。

改变喷口的尺寸是调整气泡直径的另一种方法。可以通过改变流动聚焦处喷口的尺寸来动态改变微气泡的直径。通过在微流体装置中加入一个压力驱动阀,并在喷口两侧设计可以导入空气的臂,就可以动态的调整喷口尺寸来调整气泡大小(图2a)。增加阀门的气体压力,喷口缩小,产生较小的气泡。降低通入阀门气体压力则可形成更大的气泡。

利用微流控技术生产微气泡插图1 利用微流控技术生产微气泡插图2

图2、a:动态调整喷口的流动聚焦芯片设计;b:通过真空调整微气泡尺寸的微流控结构

另外一种调整微气泡大小的方法是将真空应用于蛇形通道中,由于PDMS具有透气性,气泡中的气体可通过PDMS芯片中的蛇形通道的外壁扩,扩散到旁侧的真空通道中(图2b)。实验表明,在不施加真空时,气泡直径收缩10 μm (95 μm到85 μm),施加真空后气泡的直径缩小到5 μm并可长时间处保持不变。

3、使用微流控技术大规模的生产微气泡

目前实验室使用超声的方法生产微气泡,产量可以达到108个/秒。虽然微流控技术在产生高度均匀的微气泡方面有优势,但生产效率很低,大多数情况下生产率为<104个/秒。

气泡产生装置的平行化可增加了微气泡的生产效率,通过数个甚至数百个流动聚焦装置,可以大幅度的提高生产效率。

另外一种改进的流动聚焦结构具有两种气泡形成机制:气泡流或气泡喷雾(图3)。通过在流动聚焦喷口后宽出口通道和突然加倍通道深度,引入突然的压降来实现的大量微气泡生成。在气泡喷雾状态下,生产速度可以达到106个/秒(235mL/h)。

利用微流控技术生产微气泡插图3

图3、a:气泡流模式;b:气泡喷雾模式

4、微气泡外壳和填充气体的选择:

常用的微气泡的填充气体多为空气或者氮气。由于空气和氮气较易溶于水,长时间后会造成微气泡体积的缩小和气泡融合。目前常用的填充气体为水中溶解度很低的八氟丙烷、全氟丁烷或六氟化硫。

相较而言,外壳成分对微气泡稳定性的影响更大。为了稳定微气泡的气液界面,微气泡的外壳中经常含有高浓度的表面活性剂。这些稳定剂吸附在气泡的表面,阻止气泡融合并减缓气体的溶解。脂类是气泡外壳中常用的表面活性剂,主要的脂质成分是磷脂,如:

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC)、

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocho line (DPPC)。

1,2-dioleoyl sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-(cap biotinyl) (DOPE-B) 和

1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (DSPE) 、

1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phos phate (DPPA)。

用于微气泡的其它稳定剂包括高分子聚合物,如聚环氧乙烷-聚环氧丙烯-聚环氧乙烷((PEO)x-(PPO)y-(PEO)x,也称为Pluronic)。

微流控技术在纳米颗粒合成中的应用缩略图

微流控技术在纳米颗粒合成中的应用

纳米颗粒是指粒径小于100 nm的颗粒。纳米颗粒的主要成分是碳、金属、金属氧化物和有机物。纳米颗粒在药物递送、成像和生物传感等领域显示了巨大的应用潜力。由于拥有很大的表面积/体积比,纳米颗粒表现出许多独特的特性。由于纳米颗粒的理化性质主要取决于其大小和形态,合成具有可控大小和形状的纳米颗粒就显得格外重要。微流控技术可以更精确的控制纳米颗粒的大小和形状,合成的纳米颗粒粒径分布也更窄,因此在微流控器件中合成纳米颗粒比传统合成工艺更具优势。本文将概述使用微流控芯片合成纳米颗粒的方法,以及较传统合成方法的优势。

传统合成纳米颗粒的方法

传统合成纳米颗粒的方法有两种:“自下而上”的方法如沉淀、溶胶-凝胶和热解,或者“自上而下”方法如机械研磨、纳米光刻和热分解。纳米颗粒的形成过程可以分为以下几个阶段:通过物理激活/混合起始反应、颗粒成核、颗粒生长和颗粒形成。通过改变反应参数和条件,可以形成合适大小和形态的纳米颗粒。由于宏观反应中的反应条件随机波动大,批量反应中颗粒混合和分离更加困难,控制反应条件在技术上格外具有挑战性。直接后果就是纳米颗粒粒径不均一和批次差异大。这些问题的存在,都推动了微流控技术在该领域的应用发展。

微流控技术生产纳米颗粒

微流控器件可以高度重复和高通量的方式制备纳米颗粒。微流控芯片可以操控微米尺度通道中的流体,被广泛应用于纳米技术领域。微流控芯片中的微反应器通常是管状结构,内部尺寸通常小于一毫米,纳米颗粒的合成在微反应器中进行。微流控芯片通常用高分子聚合物,如PDMS或玻璃制成。多篇发表文献已经表明,使用微流控装置可大幅度提高反应得率,并改善粒径和形状分布。用微流控系统[6]也可以合成各种形状的非球形颗粒。

微流控技术在纳米颗粒合成中的应用插图

图1、纳米颗粒合成方法的示意图。(a)批量法;(b)单相流;(c)气液多相流;(d)液液多相流。Ma et al. “Controllable synthesis of functional nanoparticles by microfluidic platforms for biomedical applications”

 

可应用于纳米颗粒合成的微流控系统分为两类:

单相连续流体系统

多相流体系统

1、单相连续流体系统

单相连续流系统是第一种成功合成纳米颗粒的微流控装置。各种类型的纳米颗粒,如胶体金、量子点和脂质体,均可在单相系统中通过自组装和纳米沉淀制备出来。

在单相系统中,单一流体或多个流体形成的连续层流流过微反应器,成核和生长均在微反应器中发生。单相系统确保了整个反应的条件均一,反应物能够快速扩散和混合。在微流控芯片中,反应物混合主要通过层流扩散,通过控制微流控芯片中通道的几何形状可以用来精确地控制混合和反应时间,从而高度重复地形成预期尺寸和形状的纳米颗粒。单相系统允许在连续反应或多步反应过程中添加试剂,提供了反应条件控制的灵活性。反应的放大也较为直接,通过在同一芯片上同时进行多个反应既可提高产量。

微流控技术在纳米颗粒合成中的应用插图1

图2、单向连续流反应体系。Wang et al. ”A rapid pathway toward a superb gene delivery system: programming structural and functional diversity into a supramolecular nanoparticle library”

2、多相反应体系

具有多相流的微流控装置,也被称为分段流或液滴微流控。它由两种或几种不可混溶流体形成分散段。流动相可以是液体(通常是油/水或水/油体系)或者气体。分散段作为小的单独反应室,当分散段在微流控芯片通道内移动时,在每个段内均发生混合和反应。与单相系统一样,微通道的几何形状可被设计来优化混合和反应时间。液滴的体积通常在皮升左右,小的反应体积有利于高效的热交换和提高反应速度。

反应在空间上进行隔离降低了相互污染和通道堵塞的风险,也提高了合成的重复性。但是,在需要多步反应和连续修饰的时候,因为很难在封装的液滴中添加试剂,所以多相系统不如单相系统灵活。与单相系统一样,多相系统也可以通过并行以增加产量。

应用微流控技术生产纳米颗粒的优劣比较

与传统合成技术相比,微流控系统在合成纳米颗粒时有以下几个优点。具体优缺点如下:

优势:

缺点和挑战:

高重复性

存在污染和通道堵塞的风险

试剂消耗量较低

纳米颗粒可以通过PDMS扩散

方便控制实验参数

自动化比较困难

混合效果更好

复杂的设备设计

方便集成传感单元和反馈控制

有时需要特殊设计

减少了合成时间

空间分离

在微流控的流动体系中,成核、生长和形成过程可以在空间上分离,从而发生在不同的地方;而在传统方法合成中,这些步骤同时发生在反应釜中。在传统合成反应中,由于缺乏颗粒的充分混合和分离,团聚的发生几乎不可避免,导致合成除的颗粒的尺寸和形状更不均一。在微流控装置中将各个反应步骤在空间上分离的另一个优势是,装置的每个部分都可以优化设计成适于那里发生反应的条件,从而有利于实现高反应率和放大生产。

反应参数的微调

在微流控系统中,可以方便地控制温度、pH、试剂浓度和流速等各种实验参数并进行微调,以合成期望特性的纳米颗粒。由于微流控器件的尺寸较小,可以快速改变温度等反应条件。灵活快速的改变反应参数可以更好地控制反应,并可以快速筛选并找到佳的反应条件。微流控器件也为传感器集成和实时反馈,从而完成过程优化和在线表征提供了新的可能。

常用的微流控混合

被动和主动混合是微流控装置中纳米颗粒形成的关键步骤。由于大多数微流控装置中液体流动都呈层流,混合主要靠层流之间的扩散。连续微流控通道中的样品的混合时间可用以下公式近似计算:

微流控技术在纳米颗粒合成中的应用插图2

其中w是通道宽度,D是中心流中溶剂的扩散率,R是中心流速与周围流的流速之比。因此,混合时间可以通过适当的芯片设计和控制流速来控制。为了提高混合性能,单相系统通常由T形、Y形、同轴管、流动聚焦、鱼骨形混合器和微混合反应器等结构组成。其中一些混合技术如图4所示。

微流控技术在纳米颗粒合成中的应用插图3

图3。常用微流控混合技术(a)Y型微流控装置。T形微流控装置。(c)流动聚焦装置(d)鱼骨形微混合器。

微流体系统作为高度可控的纳米颗粒的平台,已显示出巨大的潜力。 应用微流控技术合成的纳米颗粒质量更高,有望加速纳米颗粒在生物医学应用中的研究。 微流体合成纳米颗粒的挑战在于如何将概念验证转化为临床和工业应用。 在应用的过程中,还必须解决制造、自动化和通道堵塞方面的挑战。 尽管如此,微流体技术在解决当前的一些技术挑战,大规模、高性价比的纳米颗粒合成的发展方面仍具有巨大的潜力和广阔的前途。

 

友情备注:

FluidicLab提供标准的流动聚焦和鱼骨形微混合器,并提供完整的流体控制方案。如有需要,敬请垂询。