固蓝B盐紫外分光光度法检测维生素C-脂质体包封率

2025-10-11
FluidicLab
维生素C-脂质体

一、背景

维生素C又名抗坏血酸，是一种水溶性的维生素。其中L-抗坏血酸被认为是四种异构中具有最高生物活性的。维生素C具有强还原性，具有抗氧化、抗炎、抗凝血和免疫调节特性。维生素 C 在胶原蛋白合成和坏血病预防中起着重要作用^[1]。

脂质体包裹传统方式包括薄膜水合法、旋转蒸发法、膜挤出法等，常搭配超声进一步降低粒径和多分散性指数（PDI）。然而这些方法产出的脂质体，具有粒径大而不均一的问题，同时药物使用率低、包封率低。FluidicLab（上海澎赞生物科技有限公司）近期利用微流控设备（NP-S2）及芯片（LNP-C2芯片）成功制备了维生素C-脂质体（Vc-Liposome）。使用微流控的方法进行脂质体的制备，高度可控，高度可重复。近期受到了越来越多的关注。

然而我们发现，针对脂质体包裹的维生素C使用率、包封率的检测成为了一大难题。常规的维生素C检测有以下几种方式：1）高效液相色谱，或色谱-质谱联用检测；2）2,6-二氯靛酚滴定法；3）基于啡罗啉显色反应的分光光度法；4）直接紫外分光光度检测；5）固蓝B盐紫外分光光度法。维生素C-脂质体作为检测样本，方案1~4均有较为明显的缺陷，详细原因见附录-附件。最后通过查阅文献^[2]，我们最终采取了固蓝B盐紫外分光光度法对维生素C包封率进行了检测，并对其进行了优化。

二、试剂材料准备

试剂	0.2M Na2EDTA（EDTA二钠）	#1
	0.5M CH3COOH（乙酸）
	固蓝B盐
耗材	5mL EP管
	石英比色皿	#2
	15mL离心管、枪头若干
仪器设备	紫外分光光度计

#1：Na2EDTA具有比EDTA更好的中和能力

#2：固蓝B盐检测法检测波长为420nm，石英比色皿可用于190-900nm全波段检测，玻璃比色皿仅用于可见光波段。420nm接近紫外区，建议使用石英比色皿以提高检测精度。

三、试剂配置

1.固蓝B盐溶液的配置

终浓度为：2g / L，

称取0.5g，溶于250 mL ddH2O中。避光，现配现用。

# 注意固蓝B盐危险代码为R45: 可能致癌；R61: 可能对未出生的婴儿造成伤害；R20/21/22: 吸入、皮肤接触和吞食有害。使用和配置过程中请穿好实验服，佩戴手套、口罩、防护镜，确保使用安全。

2.进行预混液反应液【Mixture】的配置：

【Mixture】=

+ 225 μL 【Na2EDTA (0.2 M)】+ 300 μL 【CH3COOH (0.5 M)】
+ 750 μL 【固蓝B盐溶液(2 g /L)】+ 225 μL 【1×PBS】补足

【Mixture】准备数量：

破乳前后各要进行一次标曲的制备，准备：

(6 × 2 + 样品数 ) + 2 个冗余反应的【Mixture】

3.打开紫外分光光度计进行预热，一般至少预热10min。

四、标曲制备

1.空包脂质体+Vc的标曲制备。 #用于破乳前Vc含量的测定

500 μL【空包脂质体】+ 500 μL 【Vc标准品】+ 【1×PBS】 定容至1.5 mL；

【Vc标准品】的配置，可配置2.5份：

+ 0 / 10 / 20 / 50 / 100 / 200μL 【1mg/mL】PBS-Vc+500/490/480/450/400/300μL 【1×PBS】

## 请使用合适的移液枪精确吸取

## 该体系等效于0.5 mL样品中，Vc含量为0；20；40；100；200；400μg/mL Vc；

## 脂质体本身于420nm波长处有一定的吸收，故在做标曲的时候，破乳前后500μL的脂质体添加是必要的（见附录-图4.）；

## 一般标曲作6个标准点能做到较高的准确性。根据紫外分光光度计的检测灵敏度和检测极限，可进行适当调整。一般确保最高吸光度低于1.5较为可信。

2.空包脂质体+Vc+破乳的标曲制备 #用于破乳后Vc含量的测定

500 μL【空包脂质体】+ 500 μL 【Vc标准品】+ 375μL【8% Triton X-100】+125μL【1×PBS】

静置3min确保破乳充分。

3.随后将制备好的1.5 mL标曲加入1.5 mL【Mixture】，合并为3 mL，静置30min后进行检测。

五、检测

1.破乳前待测产物= 500μL【待测原液产物】+ 1000 μL【1×PBS】稀释或
2.破乳后待测产物= 500μL【待测原液产物】+ 375 μL【8% Triton X-100】 + 625 μL【1×PBS】

##破乳需要额外加入破乳剂。为了测量体系的一致，非破乳标曲也需要加入PBS来统一体积。维生素C-脂质体一般需要浓缩，也可根据浓度情况，对产物再做稀释后，取500μL。

3.加入1.5 mL 【Mixture】，组成3 mL的反应测量液体；

4.在配置完成后静置30min；

5.设置波长：420nm；

6.加入3 mL ddH2O石英比色皿进行调零；

7.进行破乳前标曲的测量（图1.A 右侧）；

8.对破乳前样品进行检测；

9.进行破乳后标曲的检测（图1.B 右侧）；

10.对破乳后样品进行检测；

如图1. A-B所示破乳前后，相同浓度的维生素C也存在差异。故两个标曲是必要的。

11.根据各自的标曲算出维生素C的浓度，并得到包封率和利用率。

1）进行包封率的计算，公式为：

载药量= 破乳后读值 - 破乳前读值

包封率(%) = [载药量/破乳后读值] × 100%

2）同时可进行RNA利用率的计算，公式为：

RNA利用率 (%) = [载药量/RNA投入量] × 100 %

参考文献

(1)Grădinaru, A. C.; Popa, S. Vitamin C: From Self-Sufficiency to Dietary Dependence in the Framework of Its Biological Functions and Medical Implications. Life Basel Switz. 2025, 15 (2), 238. https://doi.org/10.3390/life15020238.

(2)Wang, R.; Ma, C.; Yan, H.; Zhao, H.; Wang, P.; Zhang, S.; Ju, J.; Yu, S.; Yin, Z. Lecithin/Cholesterol/Tween 80 Liposomes for Co-Encapsulation of Vitamin C and Xanthoxylin. ACS Appl. Nano Mater. 2024, 7 (6), 5982–5995. https://doi.org/10.1021/acsanm.3c05884.

附录

1）高效液相色谱，或色谱-质谱联用检测；

无论是HPLC或者LC-MS，首先需要有昂贵的检测设备以及耗材。需要超高纯度的试剂来降低污染且操作流程复杂，导致了使用的高门槛。配方优化中，需要每一种测试条件够以低成本，高效地进行包封率检测。而方法1）与该需求是相悖的。所以我们最先排除了它。当然，如果后续实验配方已经确定，并且需要进一步的精确测量，HPLC及LC-MS仍然可以是首选方案。

2）2,6-二氯靛酚滴定法；方法2）是国标的维生素C检测方式之一。其滴定终点会呈现淡淡的粉色（图1）。

我们也按照国标检测步骤进行了测试。该方法的优点是，滴定对于乙醇，pH，甚至Triton X-100等破乳剂干扰影响不显著；同时，操作及其简便，检验快速。但对于标准品的滴定发现，即使100μL滴定量的偏差（约相当于50μg的维生素C滴定量），按要求静置15秒后粉色颜色的深浅差异也并不明显，依赖主观判断。特别是2,6-二氯靛酚滴定终点的浅粉色还会随时间逐渐消退。故该方法舍弃不用。

3）使用菲啰啉显色反应进行检测。

该方法虽对于标准品有很好的线性关系，但相关试剂的配置用到了大量乙醇，会直接导致脂质体被溶解和破坏，释放维生素C，令包封率检测结果偏低。故该方法也不适合脂质体包裹维生素C的包封率检测。

4）直接用紫外分光光度计检测。

我们对标准品进行了光谱扫描。我们发现，在稀硫酸中的维生素C的吸收峰位于243nm附近（图2.），符合文献报道的245nm吸收峰：