目录

实验方案:微流控混合方式制备壳聚糖纳米颗粒
1.配制试剂
2.微流控合成操作流程
3.初产物处理
4.粒径与PDI的检测
5.产物处理与储存

实验方案:测定壳聚糖siRNA纳米颗粒包封率

实验方案:壳聚糖 siRNA细胞转染以及转染效率

附录

实验方案：微流控混合方式制备壳聚糖纳米颗粒

壳聚糖纳米颗粒（Chitosan Nanoparticles, CS NPs）作为一种具有广泛应用的纳米材料，因其良好的生物相容性、生物降解性、非毒性、可调节性以及能够载药等优点，在生物研究、药物递送、医疗、食品、环境保护等多个领域得到广泛研究与应用。如：进行体外细胞siRNA的递送^[1]，使靶基因沉默。通过将药物载入壳聚糖纳米颗粒中，可以实现药物的缓慢释放^[2]。壳聚糖纳米颗粒包裹保护活性成分后（如维生素^[3]、矿物质^[4]、益生菌等^[5]），可以提高递送效率。此外，壳聚糖纳米颗粒还被用于土壤修复，吸附和去除土壤中的污染物。在其中载入农药，还可以进行农业虫害防治^[6，7]。另外较小尺寸的壳聚糖纳米颗粒通过载入美容产品中的活性成分（如透明质酸、肽类、植物提取物等），从而帮助这些活性成分传递到皮肤的深层^[8，9]。具有较为广泛的应用前景。

目前已有多种制备壳聚糖纳米颗粒的技术，例如离子凝胶法、乳液滴法、喷雾干燥法、凝聚法以及自组装化学修饰法等。在不同的CS NPs合成方法中，离子凝胶法是最常用于制备CS NPs的方法，因为该方法作用条件温和，并且使用无毒溶剂和安全的交联剂。该方法涉及带正电荷的CS氨基与阴离子小分子(即硫酸钠、三聚磷酸钠（Sodium Tripolyphosphate, TPP）等）的离子相互作用，从而形成基于CS的NPs。其中TPP阴离子交联剂被认为是最可利用、无毒和安全的CS交联剂。

离子凝胶化法合成CS/TPP NPs尽管在工艺优化方面做出了大量努力，但该方法生产效率低、批次重现性较差、制作过程耗时。而微流控作为新兴技术，在合成CS/TPP NPs方面表现出了显著的优势。与传统的离子凝胶化法相比，微流控技术能够在更精确的流速控制下，按照微流控芯片既定的流道进行流动混合，提供了更佳的批次均匀性。本方案将通过微流控技术结合离子凝胶法原理合成壳聚糖纳米颗粒（CS/TPP NPs）以及壳聚糖/siRNA纳米颗粒的实验方法。

实验目的：

使用微流控的方式合成CS/TPP纳米颗粒以及CS/TPP-siRNA纳米颗粒

实验原理：

在稀酸溶液中，壳聚糖(CS)分子链上的氨基被质子化为阳离子型的NH3+;三聚磷酸钠(TPP)是一种阴离子交联剂，其溶液中含有大量带负电荷的PO-基团。在水溶液中，壳聚糖分子链上的NH3+与PO-发生结合而形成稳定的壳聚糖纳米颗粒。具体反应过程如下式所示：

Chitosan-NH₃⁺-AC + TPP-PO^-Na⁺→Chitosan-NH3⁺-PO-TPP

由于siRNA在其磷酸骨架上携带负电荷，能与带正电的壳聚糖通过静电作用形成稳定的纳米复合物，其中选择TPP作为交联剂来连接壳聚糖聚合物，可以形成及CS/TPP-siRNA纳米颗粒。

实验材料：

试剂	水相1（仪器脂相）	壳聚糖（C6H11NO4)n	CAS：9012-76-4
		醋酸（C2H4O2）	CAS：64-19-7
	水相2/3（仪器水相）	三聚磷酸钠（Na5P3O10)	CAS：7758-29-4
		吐温80（Tween 80）	CAS：9005-65-6
		siRNA
	蔗糖  CAS：57-50-1
溶剂	去离子水
耗材	合成需要	BD/安得（AD）/KDL注射器套筒
		不同型号带鲁尔口的注射器若干
		Falcon 15mL、50mL离心管
	过滤	0.22μm PTFE滤膜
	微混合芯片	FluidicLab C2
设备	试剂合成	pH测试计
		涡旋仪
		温控水浴锅
	微流控合成	FluidicLab智能纳米颗粒合成仪（型号：NP-S2）
	检测	动态光散射仪（型号：Malvern ZS90）
	冷冻干燥	冷冻干燥机

实验步骤：

1.配置试剂

根据参考文献^[10]，壳聚糖需要乙酸促溶，而后续需要加吐温80作为表活和稳定剂。所以我们除了壳聚糖和TPP外，需要额外加入乙酸和吐温80两样辅料。随后进行的预实验发现，吐温80与壳聚糖混合后，纳米颗粒合成效果不佳（结果未展示）。故我们选择使用乙酸促溶CS；TPP与吐温80进行混合作为微流控混合的两相液体。

水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

吸取100μL的纯醋酸溶液到50mL离心管中，加入约10mL的去离子水；称取0.2g的壳聚糖，放入含有稀醋酸溶液的50mL离心管中，利用涡旋仪，进行涡旋混合；待大部分壳聚糖粉末溶解后，加入去离子水定容至20mL，进行涡旋混合，60℃水浴30min左右，促进溶解；利用0.22μm PTFE滤膜过滤，去除未溶解颗粒及杂质后利用pH计测量溶液pH值。pH应当在4.5左右。

由于pH高低会影响物质解离，所以不同的pH下，等量的CS/TPP会提供不同数量的NH3+和PO-离子，从而导致CS/TPP NPs的合成结果差异。我们的测试发现，在pH4.5的情况下，合成的CS/TPP NPs质量是最好的（附录-附件一.1）。

CS/TPP NPs-水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP(1mg/mL)+0.5%（v/v)吐温80

称取0.2gTPP粉末，加入50mL离心管中，利用去离子水定容至20mL，配置10mg/mL的TPP母液；吸取4mL的TPP母液，加入20mL去离子水进行溶解；加入200μL的吐温80，进行充分溶解，利用去离子水定容至40mL；利用0.22μm PTFE滤膜过滤，去除未溶解颗粒。我们发现吐温80的存在会影响合成粒径大小以及粒径的分布。随着吐温80体积比的增加，粒径逐渐减小，但PDI逐渐增大（附录-附件一.2）。

此外，有效成分的质量比（附录-附件一.3）、双水相中有效成分的浓度（附录-附件一.4）会显著影响CS/TPP NPs合成的粒径和PDI。当且仅当壳聚糖（CS）浓度达到10mg/mL（含有0.5%醋酸），且三聚磷酸钠（TPP）溶液：浓度达到1mg/mL（含0.5%（v/v）吐温80）时，合成的CS/TPP NPs纳米颗粒在保证粒径分布较为均一的前提下，粒径、PDI相对较小。

注意：试剂推荐现用现配，并恢复至室温使用。目前，我们探索发现TPP的期限2 day（附录-附件二.1），壳聚糖可以保存4 day（附录-附件二.2），但试剂配置较久后CS与TPP的电离离子数目可能失衡，影响CS/TPP NPs的合成效果。此外，温度也对合成有一定的影响，请务必将试剂平衡至室温后进行合成（附录-附件二.3）。

CS/TPP-siRNA NPs水相3-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP(1mg/mL)+0.5%（v/v)吐温80+siRNA(30ng/μL)

将siRNA利用1mg/ml含0.5%（v/v）吐温80的TPP水溶液（水相2）进行稀释，将siRNA浓度稀释为30ng/μL。稀释好的siRNA、TPP、吐温80混合溶液，常温下孵育30min。

2.微流控合成操作流程

·可使用FluidicLab NP-S2 快速合成

对于智能纳米颗粒合成仪器的使用方法，可观看我司网页上传的操作指导视频（https://www.bilibili.com/video/BV1Kg4y127tc?spm_id_from=333.1387.collection.video_card.click）

或参考我司LNP合成实验指南(https://www.fluidiclab.com/mrna-lnp-s1/)

（1）由于试剂都是水相溶液，因此预清洗建议使用0.22μm PTFE滤膜过滤超纯水，进行智能纳米颗粒合成仪器NP-S2，脂相与水相的预清洗。智能纳米颗粒合成仪器实验参数推荐设置流速比为1：1，总流速12mL/min，产物0mL，前废液1mL，后废液0mL。

（2）将水相1壳聚糖（CS）溶液放置在智能纳米颗粒合成仪器NP-S2的脂相位置，水相2或带有siRNA水相3三聚磷酸钠（TPP）溶液放置在仪器的水相位置。通过测试，我们发现合成空包CS/TPP NPs时，智能纳米颗粒合成仪器实验参数设置为流速比1：3，总流速16mL/min，最有利于NPs的合成，可以获得粒径较小且均匀的CS/TPP NPs及CS/TPP-siRNA NPs。

（3）后清洗时，由于使用壳聚糖溶液具有一定粘性，因此推荐增加清洗体积。智能纳米颗粒合成仪器实验参数推荐设置为流速比1：1，总流速12mL/min,产物0mL，前废液2mL，后废液0mL，重复清洗3次。

（4）在优化流速比的过程中发现，在双水相浓度不变的情况下，流速比的改变会显著影响NPs粒径的大小和PDI。流速比和粒径、PDI的关联见附录-附件三.1。

     此外，我们在探索中发现，产物中TPP、CS终浓度一致不代表其合成NPs的产物质量一致。如：CS（10 mg/mL）：TPP（1 mg/mL）流速比=1：3合成的产物，对比CS（5 mg/mL）：TPP（1.5 mg/mL）流速比=1：1合成的NPs产物。两者终浓度均为2.5mg/mL的CS及0.75mg/mL的TPP，但是CS/TPP NPs粒径大小具有显著性差异。该实验结果表明，NPs的合成本质是动态流动控制的反应过程，并非是一个静态合成的过程，并且该形成过程受流体动力学参数的显著影响。因此利用NP-S2智能纳米颗粒合成仪器按照优化后的结果进行CS/TPP NPs的合成，会更具有稳定性与可重复性。（具体实验数据参考附录-附件三.2）

3、初产物处理

由于初合成的NPs凝胶网络仍然存在去离子水溶剂中，电子束的热量促进了分子间的联系，会导致合成的单个颗粒以极快的速度（秒/分钟级）融合成一个整体^[11]。从而导致合成的NPs产物中含有少部分粒径大于1μm的产物，因此我们建议使用0.22μm PTFE滤膜对初产物进行过滤，即可以获得粒径较小，且均一性较好的纳米颗粒。后续再进行稀释检测粒径与PDI。（具体实验数据参考附录-附件四）。

4. 粒径和PDI的检测

合成的NPs 可以使用动态光散射仪进行检测，其中主要检测指标为粒径与PDI（均一度）。由于CS/TPP NPs合成所需溶剂都为去离子水，因此我们推荐使用去离子水按照产物：水=1：1比例进行稀释（稀释浓度的具体影响参考附录-附件五），从而减少合成产物检测消耗，并提高检测准确度。正常通过本方案实验参数合成的CS/TPP NPs结果如下图1所示。

图1 CS/TPP NPs 动态光散射仪检测结果（三次检测）

空包CS/TPP NPs与负载siRNA的CS/TPP-siRNA NPs，粒径与PDI相差并不大，并且均一性都较好。siRNA影响壳聚糖纳米颗粒，粒径与PDI的结果（具体实验数据参考附录-附件六）。

5、产物处理与储存

我们的实验结果表明，短期（48h内）时间，滤后的初产物直接储存在4度可以保持CS/TPP NPs的稳定性。

CS/TPP NPs若以水悬浮液形式长期储存，容易发生体积膨胀甚至破裂。颗粒中聚合物可能发生溶解或降解，从而导致药物泄漏或解吸附^[12,13,14]。

因此，对于长期储存，推荐在滤后初产物中添加5%w/v的蔗糖当作冷冻保护剂，使用冷冻干燥机将样品在-60 °C下冷冻3 h，并在减压条件下（<50Pa）冷冻干燥15~24h，从而保持CS/TPP NPs的重悬浮性和分散性。

冻干后，重悬CS/TPP NPs需要通过超声处理10分钟并在双蒸馏水中手动摇动重构纳米颗粒，进行后续实验使用。若重悬后不立即使用，可以暂时（24h内）存放在4度。（具体实验数据参考附录-附件七）

参考文献

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[14] Rampino A, Borgogna M, Blasi P, et al. Chitosan nanoparticles: Preparation, size evolution and stability. Int J Pharm. 2013;455(1–2):219–28.

实验方案：测定壳聚糖siRNA纳米颗粒包封率

实验目的：

对使用微流控混合方式制备壳聚糖/siRNA纳米颗粒的包封率进行检测。

实验试剂:

试剂	Qubit™ microRNA 定量试剂盒（Q32880，Invitrogen）
	琼脂糖凝胶电泳相关试剂
耗材	Axygen 0.5ml 离心管（MCT-500-T，Axygen)
	枪头若干
	琼脂糖凝胶电泳相关耗材
仪器设备	Qubit 4.0 Invitrogen
	琼脂糖凝胶电泳相关仪器

实验步骤：

注：检测siRNA浓度步骤可以参考Qubit™ microRNA 定量试剂盒说明书

将siRNA壳聚糖纳米颗粒合成试剂水相3：siRNA、TPP、吐温80混合液，进行siRNA浓度检测，计为C1。

合成的siRNA壳聚糖纳米颗粒悬浮液。使用超瞬时离心方法，将siRNA负载的壳聚糖纳米颗粒与未包封的自由siRNA分离，将上清液进行siRNA浓度检测，记为C2。

siRNA负载的壳聚糖纳米颗粒，计算包封率=（C1-C2/C1）*100%

利用琼脂糖凝胶电泳进行进一步的验证，制备2%琼脂糖凝胶，在1×TAE缓冲液进行电泳。分别加入40μL的siRNA壳聚糖纳米颗粒合成试剂水相3：siRNA+TPP+吐温80混合液、空载的壳聚糖纳米颗粒、siRNA负载壳聚糖纳米颗粒的上清液，三种样品。

利用100V电压进行电泳，电泳时间设置为60分钟。

将电泳完毕的琼脂糖凝胶，使用紫外照射仪照射，并观察siRNA条带的迁移。

游离siRNA包封率及琼脂糖凝胶电泳检测结果如下图1所示。其中，图B琼脂糖凝胶电泳结果。siRNA被包裹入壳聚糖后，纳米颗粒无法通过琼脂糖间隙从而被截留于加样孔内，只显示出游离siRNA的荧光，有力地证明了siRNA被包裹在壳聚糖纳米颗粒中。

图1

图A：游离siRNA浓度检测包封率

图B：siRNA琼脂糖凝胶电泳图

实验方案：壳聚糖siRNA细胞转染以及转染效率

实验目的：

以HEK-293T-eGFP细胞为例，对壳聚糖/siRNA纳米颗粒的转染效率进行检测。

实验试剂:

细胞培养、传代、转染相关试剂、耗材、仪器。

提取RNA、RNA逆转录、实时荧光定量PCR相关试剂、耗材、仪器。

实验步骤：

1、壳聚糖/siRNA纳米颗粒的准备

将使用微流控混合方式制备的壳聚糖/siRNA纳米颗粒进行过滤除菌，利用0.22μm的滤膜进行二次过滤。

2、HEK-293T-eGFP细胞的转染

将离心消化好的HEK-293T-eGFP细胞，利用无PS的DMEM完全培养基（10%FBS+高糖DMEM）进行重悬，并稀释到105/ml的密度，以500μL/孔的体积加入24孔板内，缓慢摇匀进行铺板。

将壳聚糖/siRNA纳米颗粒以24孔板每孔500ng的量进行添加。若试用其他规格培养皿或培养板，保证包封在壳聚糖/siRNA纳米颗粒内siRNA最终浓度为1000ng/ml。

3、壳聚糖/siRNA纳米颗粒转染效率检测

以si-NC壳聚糖纳米颗粒转染作为对照组，以si-eGFP壳聚糖纳米颗粒转染作为实验组，培养48h之后提取HEK-293T-eGFP细胞RNA。进行逆转录、实时荧光定量PCR检测其中eGFP的表达量。如图1所示，与si-NC壳聚糖纳米颗粒相比，其eGFP表达量显著降低。证明壳聚糖-聚阴离子纳米颗粒可递送siRNA进入细胞内，并影响基因的表达。

图1 转染si-NC壳聚糖纳米颗粒、si-eGFP壳聚糖纳米颗粒后细胞eGFP的表达量

附录

附件清单：

附件一 双水相混合液中试剂相关配比对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

1、水相1的醋酸浓度=pH值对CS/TPP NPs合成粒径/PDI的影响

2、水相2中吐温80（Tween 80）的体积比例对CS/TPP NPs合成粒径/PDI的影响

3、水相1、2中，TPP或CS的比例变化对CS/TPP NPs合成粒径/PDI的影响

4、水相1、2中CS/TPP比例不变，浓度改变对CS/TPP NPs合成粒径/PDI的影响

附件二 试剂保质期及温度对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

1、TPP试剂保质期

2、CS试剂保质期

3、试剂温度的影响

附件三 微流控参数对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

1、流速比对CS/TPP NPs合成粒径/PDI的影响

2、流体动力学对CS/TPP NPs合成粒径/PDI的影响的证据

附件四 初产物过滤对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

1、初产物过滤前后的影响

2、过滤与稀释检测的顺序

附件五 产物检测稀释浓度对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

附件六 siRNA对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

附件七 产物储存条件对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

附件一 、水相混合液中试剂相关配比对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

1、水相1的醋酸浓度（pH）值对CS/TPP NPs合成粒径/PDI的影响

图1：水相1醋酸浓度=pH值与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图2：水相1醋酸浓度=pH值影响CS/TPP NPs粒径分布峰图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2；芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：

（1）0.5%HA+NaOH=pH 5：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸+1M NaOH

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

（2）0.5%HA=pH 4.54：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

（3）1%HA=pH 4.05：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 1%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

（4）2%HA=pH 3.64：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 2%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80/

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min；

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水） =1：3

实验结果：醋酸浓度升高即pH变低之后，CS/TPP NPs粒径变小，但是PDI数值均大于0.5%（pH=4.54）；1%HA（pH=4.05）、2%HA（pH=3.64）、0.5%HA+NaOH（pH=5）的粒径分布峰图变得十分杂乱；0.5%HA（pH=3.64）峰图相较单峰且均一。

实验结论：建议采用0.5%醋酸浓度即pH为4.54时，进行CS/TPP NPs合成

2、水相2中吐温80（Tween 80）的体积比例对CS/TPP NPs合成粒径/PDI的影响

图1：吐温80与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图2：吐温80影响CS/TPP NPs粒径分布峰图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2；芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：

（1）0.2%（v/v）TW80：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.2%（v/v）吐温80

（2）0.5%（v/v）TW80：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

（3）1%（v/v）TW80：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+1%（v/v）吐温80

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水） =1：3

实验结果：随着Tween80体积比的增加，粒径逐渐减小，但PDI逐渐增大，0.5%与0.2%（v/v）TW80结果相似，但0.5%（v/v）TW80粒径更小一点；1%（v/v）TW80，NPs粒径变小，但PDI数值增大，三者的峰图没有显著差异。

实验结论：建议采用0.5%（v/v）吐温80进行CS/TPP NPs合成。

3、水相1、2中，TPP或CS的比例变化对CS/TPP NPs合成粒径/PDI的影响

图1：试剂浓度（1）CS/TPP NPs产物拍摄实物图

图2：试剂浓度（2）CS/TPP NPs产物拍摄实物图

图3：CS/TPP浓度与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2；芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：

（1）10CS-2TPP：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（2mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

（2）5CS-1TPP：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（5mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

（3）5CS-0.5TPP：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（5mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（0.5mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

（4）10CS-1TPP：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水） =1：3

实验结果：按照CS：TPP=1：5的比例、两个不同浓度的合成的CS/TPP NPs都是浑浊且含有絮状沉淀，不能合成CS/TPP NPs纳米颗粒；按照CS：TPP=1：10的比例两个不同浓度的合成的CS/TPP NPs，粒径都较小，但粒径小的PDI较高。

实验结论：建议使用TPP与CS浓度比为1：10的比例进行后续的实验。

4、水相1、2中CS/TPP比例不变，浓度改变对CS/TPP NPs合成粒径/PDI的影响

图1：CS/TPP浓度与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图2：CS/TPP浓度影响CS/TPP NPs粒径分布峰图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2；芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：

（1）2-20：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（20mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（2mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

（2）1-10：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

（3）0.5-5：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（5mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（0.5mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水） =1：3

实验结果：2-20的浓度合成的CS/TPP NPs粒径较大约280nm ，PDI约为0.4，峰图具有双峰曲线，均一性较差；1-10的浓度合成的CS/TPP NPs粒径约62.55nm ，PDI约为0.4，峰图具有单峰曲线均一性较好；0.5-5的浓度合成的CS/TPP NPs粒径较小约25.65，但PDI偏大约为0.6左右，且峰图杂乱。

实验结论：建议使用浓度为1mg/mL TPP与10mg/mL CS进行后续的实验。

附件二、 试剂保质期及温度对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

1、TPP试剂保质期

 图1：TPP保质期与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图2：TPP保质期影响CS/TPP NPs粒径分布峰图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2；芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水） =1：3

实验结果：CS/TPP均使用4天前的试剂，PDI数值、NPs粒径与现配试剂结果类似，但粒径分布图多峰杂乱；只TPP使用4天前试剂，PDI数值、NPs粒径均增大，峰图杂乱结果不可靠；都使用现配试剂，PDI数值、NPs粒径、峰图结果为较好单峰。

实验结论：TPP试剂保存期限目前2天内可以正常使用，但是建议现配现用，排除无关变量影响。

2、CS试剂保质期

 图1：CS保质期与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图2：CS保质期影响CS/TPP NPs粒径分布峰图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2;芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水） =1：3

实验结果：CS使用4天前的试剂，PDI数值、NPs粒径、峰图与现配试剂结果类似；只TPP使用4天前试剂，PDI数值、NPs粒径均增大，峰图杂乱结果不可靠。

实验结论：CS试剂保存期限目前4天内可以正常使用，但是建议现配现用，排除无关变量影响

3、试剂温度的影响

图1：试剂温度与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图2：试剂温度影响CS/TPP NPs粒径分布峰图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2;芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水） =1：3

实验结果：随着温度提高，CS/TPP NPs的粒径会增大，PDI随之减小；结合粒径分布曲线观察，其中常温的合成条件峰图曲线较窄，为单峰曲线，4度和60度的试剂合成温度，曲线杂乱，且非单峰。

实验结论：CS/TPP NPs的合成所需试剂需要恢复至室温使用。

附件三 、微流控参数对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

1、流速比对CS/TPP NPs合成粒径/PDI的影响

图1：只改变CS流速比与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图2：只改变TPP流速比与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2;芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水）=如图1、2横坐标所示

实验结果：只改变CS流速比，TPP比例恒为1时，合成的CS/TPP NPs的粒径较大，均大于100nm，随着CS流速比的降低，CS/TPP NPs的粒径变小；只改变TPP流速比，CS比例恒为1时，CS/TPP NPs的粒径与PDI变小，其中流速比为1：3时粒径最小，且PDI数值也较小。

实验结论：在该实验条件下，CS与TPP水溶液的流速比使用1：3的流速比合成CS/TPP NPs的粒径与PDI较好。

2、流体动力学对CS/TPP NPs合成粒径/PDI的影响的证据

图1：流体动力学参数与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图2：流体动力学参数影响CS/TPP NPs粒径分布峰图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2;芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度与微流控参数：

• FRR=1:3-10CS-1TPP（mg/mL）：

水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水） =1：3

（2）FRR=1:1-5CS-1.5TPP（mg/mL）：

水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（5mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1.5mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水） =1：1

实验结果：当配方（1）流速比不同，分别为水相1（CS）：水相2（TPP）=1：3和配方（2）水相1（CS）：水相2（TPP）=1：1；两种配方试剂终浓度相同，均为2.5mg/mL的CS及0.75mg/mL的TPP时。两种配方合成的CS/TPP NPs粒径具有显著性差异，但两者PDI差异不明显。

实验结论：CS/TPP NPs的合成本质是动态流动控制的反应过程，并非是一个静态合成的过程，并且该形成过程受流体动力学参数的显著影响。

附件四、 初产物过滤对粒径/PDI的影响

1、初产物过滤前后的影响

图1：0.22μm PTFE滤膜过滤前后CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图2：过滤前后影响CS/TPP NPs粒径分布峰图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2;芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水） =1：3

实验结果：0.22μm PTFE滤膜过滤初产物后，CS/TPP NPs的粒径、PDI数值变小。结合粒径分布峰图观察，大于1μm的杂峰消失，count rate略微下降。

2、过滤与稀释检测的顺序

图1：过滤与稀释顺序与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图2：过滤与稀释顺序影响CS/TPP NPs粒径分布峰图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2;芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水）=1：3

过滤流程：

1、初产物先利用去离子水进行1：1稀释，再利用0.22μm PTFE滤膜过滤，吸取滤后产物1mL直接检测。

2、初产物先利用0.22μm PTFE滤膜过滤，吸取滤后产物500μL，再利用去离子水进行1：1稀释检测。

实验结果：初产物过滤后，减小CS/TPP NPs粒径与PDI，粒径分布峰图变为均一单峰；先加去离子水1：1稀释初产物，然后过滤；与先过滤初产物后加去离子水1：1稀释没有显著差异，两者粒径均减小。

实验结论：先稀释过滤或后稀释过滤都可以，但推荐初产物合成后首先过滤，再进行稀释检测，以保持初产物的浓度。

附件五 、产物检测稀释倍数对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

图1：产物检测稀释比例与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图2：产物检测稀释比例与CS/TPP NPs检测count rate数值的关系

图3：稀释比例影响CS/TPP NPs粒径分布峰图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2;芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水）=1：3

实验结果：进行不同比例稀释后CS/TPP NPs的粒径大小略微减小，但无显著差异，PDI各组之间也无显著差异；但是按照不同比例稀释后count rate 具有显著性差异，其中1：1稀释比的count rate 数值更高，检测结果相对更可靠；粒径分布峰图显示，相比于其他稀释比的粒径分布图，1：1的稀释比的峰图更均一。

实验结论：推荐产物：去离子水=1：1稀释比例利用动态光散射仪检测CS/TPP NPs。

附件六、siRNA对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

图1：siRNA影响CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图2：siRNA影响CS/TPP NPs粒径分布峰图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2；芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：

（1）空包：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80

（2）siRNA：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相3-siRNA溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80+siRNA（30ng/μL）

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相3（水）=1：3

实验结果：空包与siRNA的粒径与PDI没有显著性差异，粒径都在60nm左右，；两者的粒径与PDI分布峰图也较为均一，为单峰曲线，没有显著性差异。

实验结论：空包的CS/TPP NPs与CS/TPP-siRNA NPs的粒径与PDI没有显著差异，粒径都偏小且均一，siRNA对壳聚糖纳米颗粒的粒径影响不显著。

附件七、 产物储存条件对CS/TPP NPs粒径/PDI的影响

图1：冷冻保护剂对CS/TPP NPs影响实物图，其中+糖为添加保护剂的组别

图2：4度储存时间与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图3：添加冷冻保护剂（5%w/v蔗糖），4度储存时间与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图4：添加冷冻保护剂（5%w/v蔗糖），24h时不同储存方法与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图5：添加冷冻保护剂（5%w/v蔗糖），48h时不同储存方法与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图6：添加冷冻保护剂（5%w/v蔗糖），-80度储存时间与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

图7：添加冷冻保护剂（5%w/v蔗糖），冷冻干燥复原与CS/TPP NPs粒径/PDI关系统计图

实验条件：仪器：FluidicLab-NP-S2;芯片：FluidicLab-C2

试剂浓度：水相1-壳聚糖（CS）溶液：壳聚糖（10mg/mL）+ 0.5%醋酸

水相2-三聚磷酸钠（TPP）溶液：TPP（1mg/mL）+0.5%（v/v）吐温80=

微流控参数：流速（TFR）：16mL/min

流速比（FRR）：水相1（脂）：水相2（水） =1：3

实验结果：不添加冷冻保护剂（5%w/v蔗糖），进行-20度、-80度冻存会导致CS/TPP NPs变为浑浊不透明状态。并且不添加冷冻保护剂冷冻干燥后，会导致不能复溶重悬，均无法再测量CS/TPP NPs粒径与PDI（图1）；4度短期储存时，在48h内不添加冷冻保护剂时，CS/TPP NPs的粒径与PDI基本没有变化，添加后会使粒径增大（图2-3）。在添加冷冻保护剂储存24h和48h时间点，所有储存方法CS/TPP NPs的粒径与PDI都会增大；不同储存方法中，-20度储存会导致CS/TPP NPs的粒径与PDI显著增大，但-80度和冷冻干燥方法结果相差不大，其中冷冻干燥复原后CS/TPP NPs的粒径与PDI更小一点（图4-7）。

实验结论：短期（48h内）时间，滤后的初产物直接储存在4度可以保持CS/TPP NPs的稳定性。对于长期保存，推荐添加5%w/v蔗糖作为冷冻保护剂，进行冷冻干燥储存，复溶后短期可以储存在4度。