实验方案：聚乙烯醇(PVA)微球制备

实验目的：

本实验方案采用微滴/微球制备仪制备PVA水凝胶微球，具体过程如下：分别以5%戊二醛-聚乙烯醇(PVA)水溶液为内相，5%冰乙酸-聚乙烯醇(PVA)溶液为中间相，5% Drop-Surf微滴生成油为外相，使用PDMS-CHB芯片制备微滴。随后，在酸催化条件下结合加热处理，促进PVA与戊二醛发生交联固化，最终获得粒径均一(CV<5%)的PVA水凝胶微球。

引言：

聚乙烯醇(polyvinyl alcohol, PVA)是一种无毒、生物相容性优异、富含羟基且易于改性的人工合成高分子聚合物，在生物医学领域应用广泛^[1]。在多样形态的PVA水凝胶中，微球凭借其高亲水性、可调控的机械强度及生物降解性，成为栓塞剂、细胞封装载体和药物递送的理想材料^[1,2]。例如，Yang等制备的聚多巴胺(PDA)修饰PVA微球，在大鼠体内栓塞实验中展现出优异的栓塞性能^[3]；Majareh等开发的苯酚修饰PVA微球，则实现了地塞米松药物长达7天缓释，并证实其具有良好的机械稳定性(>90%完整率)和细胞相容性(细胞存活率>93%)^[4]。然而，传统方法(如乳化萃取、喷雾干燥)制备的PVA微球存在尺寸多分散性高(尺寸不均一)、球形度差等技术瓶颈，进而引发微球体系在临床转化过程中面临批次间差异大、栓塞定位不精准及药物释放不可控等问题，严重制约了其临床应用。

液滴微流控技术通过精准操控流体，可制备单分散和球形度俱佳的PVA微球，从而有效解决上述问题。例如，Han等利用微流控技术结合物理交联(冻融循环)成功制备单分散PVA微球，但该方法存在高能耗和生产周期长等缺点^[5]。为突破这一局限，Wang等设计了一种集成化PDMS微流控芯片(集成液滴生成、混合与预固化功能于一体)用于制备PVA微球^[6]。然而，由于PVA溶液粘度较高，在双水相体系(水相1:PVA水溶液, 水相2:戊二醛-盐酸溶液)混合过程中极易导致液滴生成不稳定。为此，FluidicLab微滴制备平台运用微流控技术，以5%戊二醛-聚乙烯醇(PVA)水溶液为内相，5%冰乙酸-聚乙烯醇(PVA)溶液为中间相，5% Drop-Surf微滴生成油为外相，使用PDMS-CHB芯片制备微滴。随后，在酸催化条件下结合加热处理，促进PVA与戊二醛发生交联固化，最终获得粒径高度均一(CV<5%)的PVA水凝胶微球。

实验材料：

实验步骤：

1.试剂配制

（1）5%(w/w) PVA水溶液配制

取0.5 g PVA粉末加入到9.5 g超纯水，置于85 ℃水浴锅中加热磁力搅拌溶解。

（2）5%(v/v) 戊二醛(GA)-PVA水溶液配制

取50 μL戊二醛加入到950 μL 5%的PVA水溶液中，振荡均匀用0.22μm针式过滤器过滤，备用。

（3）5%(v/v) 冰乙酸(HAc)-PVA水溶液配制

取50 μL冰乙酸加入到950 μL 5%的PVA水溶液中，振荡均匀用0.22μm针式过滤器过滤，备用。

2.微滴制备

(1).微滴/微球制备仪的安装连接：

微滴/微球制备仪安装连接参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“2.微滴/微球制备仪的安装连接”的部分；其连接如下(步骤③-⑦连接效果如下图所示)：

① 用气管依次连接“空气压缩机”-“气源处理装置”-“微滴/微球制备仪”；

② 将微滴/微球制备仪分别与电源、电脑连接；

③ 用气管分别将A₀(压力输出通道一)和A₁(油相15 mL储液池)，B₀(压力输出通道二)和B₁(水相1的2 mL储液池)连接，C₀(压力输出通道三)和C₁(水相2的2 mL储液池)；

④ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径0.25 mm/1.6 mm)分别将A₁(油相15 mL储液池)和A₂(通道一流量传感器)，B₁(水相1的2 mL储液池)和B₂(通道二流量传感器)连接，C₁(水相2的2 mL储液池)和C₂(通道三流量传感器)连接；

⑤ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径0.25 mm/1.6 mm)分别将A₂(通道一流量传感器)和A₃(PDMS芯片的油相入口)，B₂(通道二流量传感器)和B₃(PDMS芯片的水相1入口)连接，C₂(通道三流量传感器)和C₃(PDMS芯片的水相2入口)连接；

⑥ D为标准PDMS芯片和夹具的组合，芯片和夹具的入口通过硅胶塞密封；

⑦ 用PEEK管(内/外径0.25 mm/1.6 mm)将芯片出口E处生成的乳液导出。

(2) FluidicLabSuite软件的安装和设备的添加：

FluidicLabSuite软件的安装参考《微滴/微球制备仪使用手册 V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite软件的安装”的部分(相机和流量传感器仅需添加一次)；

(3) PVA微滴的制备和固化：

① 分别在15 mL油相储液池(通道一)，2 mL水相1储液池(通道二)和2 mL水相2储液池(通道三)中依次加入5 mL微滴生成油，2 mL 水相1(5% GA-PVA溶液)和2 mL水相2(5% HAc-PVA溶液);

② 打开空气压缩机和气源处理装置开关;

③ 在乳液出口端放置离心管接收微滴稳定前的废液;

④ 在电脑端设置通道一压力(油相，如150 mbar)、通道二压力(水相1，如300 mbar)和通道三压力(水相2，如300 mbar)排出管路和芯片中的空气;

⑤ 待管路和芯片中填充满液体后(空气被完全排出)，将整个系统由压力控制切换到流速控制，并设置通道一(油相)，通道二(水相1)和通道三(水相2)流速分别为6 μL/min(同“聚乙烯醇(PVA)微球制备”视频，非校准数据，实际流速为18 μL/min)，4 μL/min和4 μL/min;

⑥ 调整反馈值(Feedback)快速达到设定流速，并实现流速的稳定输出;

⑦ 用疏水培养皿接收一滴乳液，并在普通光学显微镜下观察其微滴的均匀性;

⑧ 待微滴生成均匀后，即可开始接收1.5 mL离心管中;

⑨ 10 min后停止收集，加盖一层矿物油密封，40 ℃加热过夜固化。

(4) PVA微球的破乳清洗：

① 去除1.5 mL离心管底部微滴生成油和上层矿物油;

② 按V_球:V_破=1:2加入破乳剂，振荡破乳;

③ 2500 rpm离心处理1 min，并去除底部破乳剂;

④ 重复上述②和③操作;

⑤ 最终将得到PVA微球分散于配制的PBS缓冲液中。

(5) 微滴/微球制备仪清洗：

微滴生成仪每次使用完必须清洗管路、流量传感器和芯片。具体操作详见“微滴/微球制备仪操作指导卡”。

结果与讨论：

刚接收的液滴平均粒径为98.47 μm，具有高单分散性(变异系数:CV=3.19%)。其显微镜图和粒径分布如下图所示：

最终接收的聚乙烯醇微球平均粒径为46.52 μm，具有高单分散性(变异系数:CV=3.75%)。其显微镜图和粒径分布如下图所示：

实验关键要点：

1. PDMS-CHB使用完毕后，须立即拔出两水相进液管，用微滴生成油将两水相反冲出以避免芯片堵塞。
2. 本方案中PVA微球固化温度为40℃，乳液上层覆盖有矿物油其目的是防止液滴融合或挥发。
3. 本方案制备微滴所用微滴生成油为5% Drop-Surf微滴生成油。

参考文献：

• Yang, et al. Controllable fabrication of monodisperse poly(vinyl alcohol) microspheres with droplet microfluidics for embolization, Ind. Eng. Chem. Res.,61, 12619-12631(2022).
• Young C., et al. Poly(vinyl alcohol)-heparin biosynthetic microspheres produced by microfluidics and ultraviolet photopolymerisation,Biomicrofluidics, 7, 044109(2013).
• Yang X., et al. Development of PVA-based microsphere as a potential embolization agent, Biomaterials Advances,135, 112677(2022).
• Majareh M., et al. Sustain release of dexamethasone from polyvinyl alcohol microparticle produced via coaxial microfluidic system, BMC Research Notes, 16, 268(2023).
• Han X., et al. Preparation of poly(vinyl alcohol) microspheres based on droplet microfluidic technology, Chinese J. Anal. Chem., 46, 1269 -1274(2018).
• Wang J., et al. Microfluidic rapid fabrication of tunable polyvinyl alcohol mMicrospheres for adsorption applications, Materials, 12, 3712(2019).