FluidicLab LNP(脂质纳米颗粒)制备系统助力客户东纳生物mRNA递送技术研究

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mRNA疫苗简介

核酸疫苗作为一种被寄予厚望的疫苗形式，相较于传统的基于生物的疫苗(如减毒活疫苗、灭活疫苗等)，工艺简单，合成时间短，安全性高。与DNA疫苗相比，mRNA不用进入细胞核，低剂量就能刺激机体产生足够的中和抗体。而且，mRNA不会整合到宿主细胞的基因组上，避免了可能的突变。传统的蛋白免疫接种只能启动CD4⁺T细胞(辅助性T细胞，Th细胞)介导的体液免疫，mRNA疫苗能激活更强烈的CD8⁺T细胞(细胞毒性T细胞，Tc细胞)介导的细胞免疫。因此，不论是安全性还是有效性，mRNA疫苗都略胜一筹。但是mRNA半衰期短，稳定性差，易被核酸酶降解失去疗效，体内递送效率较低，分子量和负离子性质也为它进入细胞膜屏障带来了巨大阻碍，如何顺利将mRNA完整且高效地递送进细胞成为一个重要议题。

非病毒载体主要包括脂质纳米颗粒（Lipid nanoparticles，LNP）、树状大分子、无机纳米粒子、阳离子细胞穿膜肽等，其中LNP递送mRNA具有独特优势：首先，LNP为球形颗粒，可将 mRNA 包裹在内，抵御核酸酶的作用；其次，LNP成分与细胞膜类似，易与受体细胞融合，转染效率高，并且不受宿主限制，可以递送不同大小片段的mRNA。

图1：LNP递送和作用原理。封装在LNP中的S蛋白mRNA被递送进细胞后，在核糖体中合成S蛋白。一部分S蛋白被细胞内的蛋白酶体切割成大大小小的肽段，与内质网上的组织相容性复合物MHCⅠ类分子结合，通过胞吐呈递到细胞表面，被CD8+T细胞识别，启动细胞免疫，即“内源性抗原”识别途径。另一部分S蛋白被分泌到胞外，被巨噬细胞等抗原呈递细胞吞噬，在溶酶体内分解成小肽段，与另一种组织相容性复合物MHCⅡ类分子结合，呈递到细胞表面，被CD4+T细胞识别，启动体液免疫，即“外源性抗原”识别途径。    图片来源：Pharmaceutics

LNP制备方法

目前在制备LNP的方法中，溶剂注入法是*简单的一种，它的基础是将脂质溶解在可与水混溶的有机溶剂(乙醇、丙酮、异丙醇)中，再经注射器注入到水中，脂质与水接触后自组装形成纳米颗粒，但是容易存在重现性差和粒径不均一等问题，需要通过某些物理手段(如脂质体挤出器等)进行挤压得到粒径均一的纳米粒子，但是通过挤压后的纳米粒子存在核酸渗漏和专用挤压设备处理量小难以扩大生产的问题。

微流控法在乙醇注入法的基础上进一步优化（如图2），将溶有脂质的乙醇溶剂和含有核酸的水溶液注入芯片的两条入口通道。在层流状态下，两种溶液不会立即混合，但在两相交汇处的Y型混合器为 LNP的制备提供了一个可控的混合环境。蛇形通道内精心设计的微观结构以可控、可重复的方式使两股流体混合在一起。通道内两股流体瞬间混合，溶剂*性发生变化，引发脂质的自组装，酸性条件下头部带正电的可电离脂质与带负电的核酸结合，疏水尾部暴露在外，再被基础脂质包裹，形成亲水外壳，胆固醇和长循环脂质镶嵌其中，调节膜的完整性和刚性，并减少非特异性相互作用，以防止储存下的聚集，*终形成载核酸的脂质纳米颗粒。该技术适用于大部分LNP配方和RNA的有效载荷，能获得较高的包封效率(＞80%)，并提高LNP结构的重现性、稳定性和可扩展性。

图2：微流控法制备LNP原理示意图（以siRNA为例）

图片来源：Mol Ther Nucleic Acids.

LNP测试与转染

       在脂质载体作为运输载体的药物运输系统中，粒径和PDI是评价纳米载体体系质量的一项重要指标，粒径大小及分布直接影响着纳米分散体系的物理稳定性，通常要求mRNA-LNP的粒径在20~200 nm之间。粒径小于20 nm的纳米颗粒容易被肾脏代谢掉，而补体系统对LNP的识别与其直径成正比，因此粒径过大对转染效果和安全性影响都较大，较小的脂质体具有较大的曲率，这反过来会影响识别位点的数量，进而减少补体系统的清除量。目前大多采用微流控技术来制备LNP，粒径一般分布在20~200 nm 之间，清除率较低，可作为药物输送应用的载体。东纳生物采用微流控法制备LNP，所制备的粒径控制在100 nm左右，PDI控制在0.2以下，如图3a。对mRNA的包封率可以达到80%以上。

含有阳离子脂质的脂质复合物用于核酸递送时，由于存在毒性和缺乏体内效力等问题，已基本被pH响应性可电离脂质所取代，生理pH下可电离脂质表现为中性，降低了细胞毒性，而在内体的酸性环境中则带正电荷，有利于 mRNA 细胞摄取和内体逃逸。东纳生物制备的LNP，纯水中的Zeta电位在0 mV左右，如图3b，表明LNP在中性条件下基本不带电荷，保证了生物相容性。将Hela细胞用RPMI-1640培养基稀释后，以1×10⁴个/孔的数量种入96孔板，以总mRNA载量计算，分别在孔中加入载0.1，0.6，1.0，2.0，4.0，8.0 μg mRNA的GFP-mRNA-LNP，共培养8 h后，加入10%胎牛血清混匀，继续共培养12 h、28 h后，倒置荧光显微镜观察，细胞转染结果如图3c。根据细胞培养结果，mRNA投料量为0.1 μg/孔时即可成功转染细胞，共培养20 h后即可观察到明显的荧光，继续培养16 h后，荧光增强。

图3：LNP的表征结果。a）水动力尺寸检测结果。b）Zeta电位检测结果。c）细胞转染结果。