实验方案:微滴/微球制备仪制备PLGA微球

实验目的

本实验方案通过利用微滴/微球制备仪,以2% PVA水溶液为水相,以5% PLGA-二氯甲烷溶液为油相制备高单分散的微滴,并在水相接收液中挥发微滴中的二氯甲烷溶剂,实现微滴的固化,*终获得具有*高的单分散性的PLGA微球(CV<5%)。

引言

药物递送系统(DDS)是一种用可持续方式向特定部位输送药物的系统,旨在通过调节*佳剂量以达到治疗疾病或减轻痛苦的作用[1]。其中,PLGA(羟基乙酸共聚物)因其优越的生物相容性和生物可降解性[1,2,3,4],在药物递送、生物传感、组织工程等领域有广泛应用[2]。在生物体内,PLGA可降解为水和二氧化碳等无毒小分子,通过Krebs循环排出[1]。作为一种药物载体,这种共聚物近年来吸引了越来越多的关注,目前已有多种含PLGA的药物上市[3,4]。一般来说,PLGA是由乳酸和羟基乙酸在催化条件下共聚而得,兼具两种化合物的性质特征,通过调节两种单体化合物的比例,即可改变共聚物的性质[1]。因此,对化疗药物、抗菌消炎和抗老化药物等药物递送系统而言,PLGA是一种理想的材料[1]

制备PLGA微球的传统方法有溶剂挥发法、凝聚和喷雾干燥法[1,3],然而通过这些方法制备出的PLGA微球往往具有较宽的尺寸分布,批次间稳定性较差,药物包封效果也不尽如人意[3]。在实际应用中,PLGA微球的尺寸的药物释放效果有至关重要的作用,单分散性不佳的载药PLGA往往会出现初始迸发释药现象,严重影响药物治疗的效果,甚至可能产生毒性[4]。因此,开发一种可重复、粒径及均匀度可控的PLGA微球制备技术是其成功应用的必要条件。

基于此,FluidicLab微滴制备平台运用液滴微流控技术,将PLGA溶解在二氯甲烷中,以PLGA-二氯甲烷溶液为油相,聚乙烯醇(PVA)水溶液为水相,通过微滴/微球制备仪制备高度均一的PLGA-二氯甲烷微滴,在室温下挥发微滴中的二氯甲烷溶剂,*终得到PLGA微球。该法操作简便,样品利用率高,制备得到的微球单分散性高(CV<5%),具有较好重复性。

温馨提示:因实验方案会持续更新优化,观看过程中如有任何问题,可通过网站上的联系方式联系技术人员获取*新版本PDF文件。

实验材料

试剂PLGA (FluidicLab, 50/50, Mw: 2W)
聚乙烯醇 (PVA,Sigma-Aldrich, P8136-250g)
二氯甲烷(Greagent)
耗材15 mL离心管(Falcon 15 mL REF 352097)若干
1.5 mL黑色离心管若干
内/外径0.25 /1.6 mm PEEK管及所需接头
10 mL和20 mL透明玻璃瓶若干
0.22 μm针式过滤器(PTFE材质)若干
10 mL注射器若干
芯片夹具GL-FF-100 芯片(FluidicLab)
玻璃标准芯片夹具(FluidicLab)
设备Fluidiclab微滴/微球制备仪(两通道)
辅助设备电脑(Win10 以上系统)
快速离心机(湖南湘仪, H1850)
普通光学显微镜(用于测微球粒径)

实验步骤

1、试剂准备

(1)、2% 聚乙烯醇(PVA)水溶液(w/v)配制

称取0.2 g PVA粉末,加入超纯水震荡,放入85℃水浴锅中搅拌加热溶解,*终定容至10 mL。用0.22 μm滤膜过滤。

(2)、5% PLGA-二氯甲烷溶液(w/w)配制

称取0.1 g PLGA粉末,加入1.43 mL 二氯甲烷(约1.9 g),超声溶解。用0.22 μm滤膜过滤。

2、微滴制备:

    (1)微滴/微球制备仪的安装连接

    微滴/微球制备仪安装连接参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“2. 微滴/微球制备仪的安装连接”的部分;其连接如下(步骤③-⑦连接效果如下图所示):

    ① 用气管依次连接“空气压缩机”--“气源处理装置”--“微滴/微球制备仪”;

    ② 将微滴/微球制备仪分别与电源、电脑的连接;

    ③ 用气管分别将A0(压力输出通道一)和A1(水相15 mL储液池),B0(压力输出通道二)和B1(油相1.5 mL黑色离心管储液池)连接;

    ④ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)分别将A1(水相15 mL储液池)和A2(通道一流量传感器),B1(油相1.5 mL黑色离心管储液池)和B2(通道二流量传感器)连接;

    ⑤ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)分别将A2(通道一流量传感器)和A3(玻璃芯片的水相入口),B2(通道二流量传感器)和B3(玻璃芯片的油相入口)连接;

    ⑥ C为标准玻璃芯片和夹具的组合,芯片和夹具的入口通过硅胶塞密封;

    ⑦ 用PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)将芯片出口D处生成的乳液导出。

    微滴微球制备仪

    (2)FluidicLabSuite软件的安装和设备的添加:

    FluidicLabSuite软件的安装参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite软件的安装”的部分;

    (3)PLGA微液滴的制备

    具体操作步骤如下:

    ① 分别在15 mL水相储液池(通道一)和1.5 mL油相黑色离心管储液池(通道二)中依次加入5 mL 2% PVA水溶液和1 mL 5% PLGA-二氯甲烷溶液;

    ② FluidicLabSuite软件的设备添加参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.2 FluidicLabSuite软件的设备添加”的部分(相机和流量传感器仅需添加一次);

    ③ 打开空气压缩机和气源处理装置开关;

    ④ 在乳液出口端放置离心管接收微滴稳定前的废液;

    ⑤ 在电脑端设置通道一压力(水相,如250 mbar)和通道二压力(油相,如150 mbar)排出管路和芯片中的空气;

    ⑥ 待管路和芯片中完全填充液体后(空气被完全排出);将整个系统由压力控制切换到流速控制,并设置通道一(水相)和通道二(油相)流速分别为14和3 μL/min;

    ⑦ 调整反馈值(Feedback)快速达到设定流速,并实现流速的稳定输出;

    ⑧ 用载玻片接收一滴乳液,并在普通光学显微镜下观察其微滴的均匀性;

    ⑨ 待微滴生成均匀后,即可开始接收至装有2% PVA水溶液的玻璃培养皿中;

    ⑩ 60 min后停止收集,随后静置一段时间,待二氯甲烷挥发完全。(注意:玻璃培养皿中的水溶液不能挥发干)

    3、PLGA微球的清洗:

    具体操作步骤如下:

    ① 将固化后的PLGA微球转移至1.5 mL离心管中;

    ② 2500 rpm离心处理1 min,并取出上部水溶液;

    ③按V:V=1:2 加入超纯水,振荡;

    ④2500 rpm离心处理1 min,并取出上部水溶液;

    ⑤重复上述③和④操作;

    ⑥*终得到固化后的PLGA微球。

    4.、微滴/微球制备仪清洗:

    微滴生成仪每次使用完必须清洗管路、流量传感器和芯片。具体操作详见“微滴/微球制备仪操作指导卡”。

    结果与讨论:

    刚接收的微滴平均粒径为62.76 μm,具有*高的单分散性(变异系数: CV=2.79%)。其显微镜图和粒径分布如下图所示:

    刚接收的微滴平均粒径为62.76 μm,具有*高的单分散性(变异系数: CV=2.79%)

    *终获得的PLGA微球平均粒径为26.62 μm,具有*高的单分散性(变异系数: CV=1.07%)。其显微镜图和粒径分布如下图所示:

    *终获得的PLGA微球平均粒径为26.62 μm,具有*高的单分散性(变异系数: CV=1.07%)。

    实验关键要点:

    1、采用本方案制备PLGA微球时,液体在通入芯片前必须用0.22 μm或0.45 μm的滤膜过滤,避免芯片堵塞影响微滴生成;

    2、采用本方案制备PLGA微球时,因二氯甲烷见光易分解,产生气泡影响液滴生成稳定性,油相溶液容器须避光,建议使用黑色不透光离心管,或用铝箔纸包裹;

    3、采用本方案制备PLGA微球时,建议在载玻片上接收一滴稳定后的乳液,并观察其粒径变化,以确定完全固化后PLGA微球的粒径;

    4、采用本方案制备PLGA微球时,固化过程中必须保证培养皿中始终有水溶液,避免水溶液挥发干后PVA固体粘附在PLGA微球上;

    5、采用本方案制备PLGA微球时,固化前后微球粒径差异与PLGA油相溶液的浓度有关,接收液滴大小相同时,PLGA浓度越大,固化后的微球粒径越大。

    参考文献:

    [1] Rezvantalab S., et al. Microfluidic assisted synthesis of PLGA drug delivery systems, RSC Adv, 9, 2055 (2019)

    [2] Lagreca, E., et al. Recent advances in the formulation of PLGA microparticles for controlled drug delivery. Prog Biomater, 9, 153–174 (2020)

    [3] Montazeri L., et al. Modification of PDMS to fabricate PLGA microparticles by a double emulsion method in a single microfluidic device, Lab Chip, 16, 2596 (2016)

    [4] Yoo J., et al. Phenomenology of the Initial Burst Release of Drugs from PLGA Microparticles, ACS Biomater. Sci. Eng, 6, 6053-6062 (2020)

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