实验方案：微流控方式制备高单分散性的壳聚糖微球

实验目的：

本实验方案通过利用微滴/微球制备仪，以Drop-Surf微滴生成油为油相，以5%壳聚糖为水相制备高单分散的微滴，并与接收液油相中的戊二醛发生Schiff碱反应实现微滴的固化。*终获得具有*高的单分散性的壳聚糖微球(CV<5%)。

引言：

壳聚糖是一种功能线性聚合物，是由甲壳素部分去乙酰化而得^[1-3]。因其来源广泛、无毒、价格低廉、良好的生物相容性和可降解而备受关注。近年来，壳聚糖作为一种新型功能材料，以纤维、膜、微球和胶囊等形式在蛋白吸附分离、催化剂载体、酶的固定化、重金属吸附和药物释放等方面具有很大的应用潜力^[2]。此外，壳聚糖在每个C₆原子单元上都有一个游离的氨基，这使得壳聚糖可以与醛基发生Schiff碱反应，且在这一反应过程中生成的C=N键发生n-π*跃迁产生自发荧光^[2]。而这种荧光恰恰可以应用于血液循环追踪、细胞外基质表征、体内细胞成像等领域。因此，壳聚糖在生物、医药、化学和环境等领域都有良好的应用前景。

壳聚糖微球粒径的均一度控制对其在生物、医药和催化等领域的成功应用至关重要。目前制备壳聚糖微球的方法有乳化固化、简单凝聚、复合凝聚和膜乳化等^[2,4]。虽然这些技术完全可行，但也存在着很大的缺点，如产率不稳定、程序复杂、粒径分布不均和重复性差等。因此，开发一种可重复、粒径及均匀度可控的壳聚糖微球制备技术是其成功应用的必要条件。FluidicLab微滴制备平台运用液滴微流控技术，通过微滴/微球制备仪制备高度均一的壳聚糖微滴，再与戊二醛发生Schiff碱反应实现微滴的固化，*终得到壳聚糖微球。该法操作简便，样品利用率高，制备得到的微球单分散性高(CV<5%)，具有较好重复性。

实验材料：

实验步骤：

1.试剂配制：

|a、5%(wt%)壳聚糖水溶液：

将0.5 g壳聚糖加入到约9.3 mL的超纯水中，并加入200 μL (约0.2 g)冰乙酸辅助溶解，振荡放置于85 ℃的鼓风干燥箱中加热溶解；待完全溶解后用0.22 μm的针式过滤器过滤备用。

|b、1%戊二醛油相溶液：

取490 μL微滴生成油，加入体积为10 μL的50%戊二醛，振荡均匀备用。

2.微滴制备：

|a、微滴/微球制备仪的安装连接

微滴/微球制备仪安装连接参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“2. 微滴/微球制备仪的安装连接”的部分；其连接如下(步骤③-⑦连接效果如下图所示)：

① 用气管依次连接“空气压缩机”--“气源处理装置”--“微滴/微球制备仪”；

② 将微滴/微球制备仪分别与电源、电脑的连接；

③ 用气管分别将A0(压力输出通道一)和A1(油相15 mL储液池)，B0(压力输出通道二)和B1(水相1.5 mL储液池)连接；

④ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)分别将A1(油相15 mL储液池)和A2(通道一流量传感器)，B1(水相1.5 mL储液池)和B2(通道二流量传感器)连接；

⑤ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)分别将A2(通道一流量传感器)和A3(PDMS芯片的油相入口)，B2(通道二流量传感器)和B3(PDMS芯片的水相入口)连接；

⑥ C为标准PDMS芯片和夹具的组合，芯片和夹具的入口通过硅胶塞密封；

⑦ 用PEEK管(内/外径 0.25 mm/1.6 mm)将芯片出口D处生成的乳液导出。

|b、FluidicLabSuite软件的安装和设备的添加：

FluidicLabSuite软件的安装参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.1 FluidicLabSuite软件的安装”的部分；

|c、壳聚糖微液滴的制备：

具体操作步骤如下(参考视频“微流控应用：微滴生成仪制备壳聚糖微球”)：

https://www.fluidiclab.com/chitosan-microspheres/

① 分别在15 mL油相储液池(通道一)和1.5 mL水相储液池(通道二)中依次加入5 mL微滴生成油和1 mL 5%的壳聚糖水溶液；

② FluidicLabSuite软件的设备添加参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.2 FluidicLabSuite软件的设备添加”的部分(相机和流量传感器仅需添加一次)；

③ 打开空气压缩机和气源处理装置开关；

④ 在乳液出口端放置离心管接收微滴稳定前的废液；

⑤ 在电脑端设置通道一压力(油相，如150 mbar)和通道二压力(水相，如900 mbar，水相黏度大，流阻大，压力更大)排出管路和芯片中的空气；

⑥ 待管路和芯片中完全填充液体后(空气被完全排出)；将整个系统由压力控制切换到流速控制，并设置通道一(油相)和通道二(水相)流速分别为20和5 μL/min；

⑦ 调整反馈值(Feedback)快速达到设定流速，并实现流速的稳定输出；

⑧ 用疏水培养皿接收一滴乳液，并在普通光学显微镜下观察其微滴的均匀性；

⑨ 待微滴生成均匀后，即可开始接收至装有1%戊二醛油相溶液的1.5 mL离心管中；

⑩ 20 min后停止收集，密封于离心管中，轻微振荡加快微滴固化，随后静置一段时间。

3.壳聚糖微球的破乳清洗：

具体操作步骤如下(参考视频“微流控应用：微滴生成仪制备壳聚糖微球”)：

https://www.fluidiclab.com/chitosan-microspheres/

① 取出1.5 mL离心管底部微滴生成油；

② 按V_球：V_破=1:2 加入破乳剂，振荡破乳；

③ 2500 rpm离心处理1 min，并取出底部破乳剂；

④ 重复上述②和③操作；

⑤ *终得到固化后的壳聚糖微球。

4、微滴/微球制备仪清洗：

微滴生成仪每次使用完必须清洗管路、流量传感器和芯片。具体操作详见“微滴/微球制备仪操作指导卡”。

结果与讨论：

刚接收的微滴平均粒径为107.53 μm，具有*高的单分散性(变异系数:CV=2.14%)。其显微镜图和粒径分布如下图所示：

通过与戊二醛发生Schiff碱反应实现微滴的固化，*终获得的壳聚糖微球平均粒径为101.67 μm，具有*高的单分散性(变异系数:CV=2.53%)。其显微镜图和粒径分布如下图所示：

参考文献：

[1] Zhao H., et al. A novel microfluidic approach for monodispersed chitosan microspheres with enhanced autofluorescence, Chem. Eng. J., 215–216, 784-790 (2013).

[2] Xu, J.H., et al. A Novel Microfluidic Approach for Monodispersed Chitosan Microspheres with Controllable Structures. Adv. Healthcare Mater., 1, 106-111 (2012).

[3] Zhu Y., et al. Microfluidic synthesis of thiourea modified chitosan microsphere of high specific surface area for heavy metal wastewater treatment, Chin. Chem. Lett.,28, 633-641 (2016).

[4] Xu, J.H., et al. Preparation of monodispersed chitosan microspheres and in situ encapsulation of BSA in a co-axial microfluidic device. Biomed Microdevices, 11, 243–249 (2009).