实验方案：使用微流控方法制备海藻酸钠微球操作教程

     

             分散于 PBS buffer中的微球                                                 微球粒径统计

 

1. 试剂

• 微滴生成油 (含2% 表面活性剂的HFE-7500 (wt%), FluidicLab)
• EDTA (0.5 M, pH 7.4 Macklin, E885215-1L)
• NaOH (Macklin, S817971-500 G)
• CaCl₂  (无水, 99.99%, Macklin, C805228-100 G)
• 海藻酸钠 (黏度 200 mpa.s，FludicLab)
• 乙酸 (99.8%, Macklin, A801296-500 ML)
• 1H,1H,2H,2H-全氟己-1-醇 (PFO, 98%, Macklin, H817022-25 G)
• HFE-7500 (3M Novec^TM)
• n-Hexane (正己烷, HPLC, H810749-1L)
• Span^TM 80 (Aladdin, S110839-250 ML)
• 娃哈哈纯净水

2. 硬件设备

• 两通道压力控制器(FluidicLab PC-1)
• 100 μm剪切口疏水的微流控玻璃芯片(液滴) （FluidicLab）
• 配套微流控玻璃芯片夹具（FluidicLab）
• PTFE 管(0.6/1.6 mm)若干
• 配有快速相机的普通光学显微镜及配套软件
• 两个流量传感器 （规格: 80 μL/min） (FluidicLab )
• 两个储液池 (规格: 15 mL和50 mL)
• 水平旋转仪 (泰州诺米医疗科技, NMY-100)
• 万分位电子分析天平
• 梅特勒pH计
• 快速离心机 (湖南湘仪H18500R)
• 100 μm细胞滤网
• 20 mL透明玻璃瓶
• 玻璃培养皿 (直径100 mm)

3. 溶液配制

(1). 4 M NaOH 

取8.0 g NaOH置于50 mL Falcon离心管中，用娃哈哈水溶解并定容至50 mL。

(2). 5 M CaCl₂

 取11.1 g CaCl₂  置于50 mL Falcon离心管中，用娃哈哈水溶解并定容至20 mL。

(3). 2 %海藻酸钠水溶液 (wt%)

取0.2 g 海藻酸钠置于15 mL Falcon离心管中，加入娃哈哈纯净水至10 g。

注意：溶解海藻酸钠时用时较久，要不断的超声并涡旋振荡，*后静置将个别碎沫慢慢溶解 (以上仅为个人建议，不同厂家溶解效果也不一样，能否做出也未可知)。

(4). 400 mM Ca-EDTA

取400 μL 的5 M CaCl₂ ，4 mL EDTA (0.5M, pH7.4)加入20 mL 透明玻璃瓶中并振荡均匀，然后用 4 M NaOH调整pH至7.2，*后加入娃哈哈纯净水定容至5 mL。

注意: 调pH加NaOH溶液时，需少量多次。初始pH为3.65左右，待加至pH为5.6以上时需尽可能减少NaOH溶液加入的量，适当可用移液枪取1 μL 或更少的量加入。

(5). 1% 海藻酸钠 (wt%)- 200 mM Ca-EDTA 

将2 % 海藻酸钠水溶液和400 mM Ca-EDTA等体积混合，使用0.22 μm PTFE微孔膜过滤。

(6). 20% PFO/HFE-7500 (v/v)

取5 mL PFO 置于50 mL Falcon离心管中，用HFE-7500定容至25 mL，振荡均匀。

(7). 1% Span 80 in Hexane (v/v)

取0.3 mL Span 80加入Hexane定容至30 mL，振荡均匀.

(8). 2 % 乙酸/微滴生成油 (v/v)

取200 μL 的乙酸加入 15 mL Falcon离心管中，用微滴生成油定容至10 mL，振荡均匀。

4. 实验操作

1. 按照“压力控制器使用手册”连接设备、储液池和两路流量传感器；
2. 将微滴生成油和1% 海藻酸钠-200 mM Ca-EDTA水相分别加入至50和15 mL的储液池中;
3. 用软件控制分别给两个通道一定的压力以排出管路中的空气，待有液体流出时再分别关掉压力;
4. 分别将油相和水相管插入经疏水处理的玻璃芯片对应的油相和水相入口，然后取一段30 cm PTFE管插入玻璃芯片出口；
5. 用软件控制并设置流速，比如油相流速为70 μL /min，水相流速为7 μL /min;
6. 待微球稳定生成后，将装有10 mL 2%乙酸微的滴生成油的玻璃培养皿放置于管路出口开始收集，且收集过程中需要用水平旋转仪振荡;       注意：水平旋转仪振荡速度50 rpm/min以下，且保证收集的微球一直能滴入培养皿中；收集时可以用保鲜膜盖在收集管上尽量减少乙酸的挥发。
7. 收集完毕后可以适当补充乙酸以保证其浓度基本维持不变，然后振荡固化12 h；
8. 待固化完全后， 5000 rpm, 3min离心处理；
9. 用移液枪取出底部油相，然后按2:1 (v_PFO:v_微球)加入20% PFO的HFE-7500，5000 rpm, 3min离心处理至少两次;
10. 用移液枪取出底部溶液，然后按2:1 (v_n-Hexane:v_微球)加入1% Span 80的n-Hexane，5000 rpm, 3min离心处理至少两次；
11. 用移液枪取出上部溶液，加入一定体积PBS 5000 rpm, 5min离心处理，*终分散于PBS中;
12. 固化后的微球可以用100 μm细胞过滤器过滤。

5. 注意事项​

1. 有关海藻酸钠：不同厂家效果可能会不太一样，也就是不能确保能否实现完全固化；海藻酸钠黏度太大不利于剪切，所以建议黏度在300 mpa.s以下。
2. 配Ca-EDTA混合液时，调节pH很重要，若pH过低则水相会直接固化；若太高则会中和油相中的酸反而不利于微球固化。
3. 本实验操作中钙离子浓度是很高的，若担心影响包裹的细胞或材料则可以尝试降低钙离子浓度。
4. 本实验中接收液乙酸浓度也比较高，也可以尝试降低，但固化时间会有所延长。
5. 接收时，要保持培养皿不断振荡以促使微球加快固化，采用FluidicLab的海藻酸钠材料时，固化后微球会团聚在一起浮在油相表面。后续可通过超声振荡促使其分开。