实验目的：
本实验依托FluidicLab液滴微流控平台，以15%葡聚糖(Dextran)水溶液、含0.25% LAP 光引发剂的10% GelMA水溶液、2% Drop-Surf微滴生成油为反应体系，制备高单分散的核壳结构微滴，并通过405 nm紫外光照射实现微滴的固化，最终获得具有极高单分散性的半透膜微胶囊(CV<5%)。
引言：
单细胞分析是解析生物异质性的关键技术，广泛应用于发育生物学、肿瘤微环境及疾病机制研究等领域[1]。液滴微流控因其高通量、微量反应体系的独特优势，成为单细胞分析的主流技术平台。但传统油水液滴为封闭体系，难以开展细胞裂解、核酸扩增、多轮洗涤等连续生化实验；依靠液滴融合、重注射优化流程的方式设备成本与操作门槛高，难以在常规实验室推广[2,3]。
为突破液滴体系的局限，多孔水凝胶微球被逐步开发，依托凝胶网格实现小分子试剂交换并截留核酸大分子，但凝胶成型阶段细胞易在油水界面大量流失，三维交联网络带来的空间位阻会抑制长链DNA合成，显著降低单细胞核酸扩增效率[4]。
针对两类体系的缺陷，基于双水相微流控构建的半透膜微胶囊(SPCs)单细胞平台应运而生[4,5]。SPCs采用液态内核搭配超薄半透水凝胶壳层的核壳结构，可截留300 bp以上核酸，允许酶、引物等小分子自由跨膜扩散，无需破坏壳即可完成多步换液生化反应，适配常规实验室操作[4,6]。该微胶囊稳定性与生物相容性优异，可耐受热循环、流式分选，酶解后可释放完整活细胞以支持单细胞克隆扩增，且已成功应用于微生物基因组扩增、细胞转录组测序等研究，对脆弱细胞的捕获性能优于商用液滴平台[6,7]。
基于此，本实验利用微滴/微球制备仪，以15%葡聚糖(Dextran)水溶液为水相1，含0.25% LAP 光引发剂的10% GelMA水溶液为水相2，2% Drop-Surf微滴生成油为油相，采用PDMS-SCE芯片制备核壳微滴，经405 nm紫外光固化，最终获得具有极高单分散性的半透膜微胶囊(CV<5%)。
实验材料：
| 试剂 | 微滴生成油 (2%,Drop-Surf, FluidicLab) |
| 破乳剂 (Drop-Surf, FluidicLab) | |
| 甲基丙烯酰化明胶(GelMA, FluidicLab, 25%取代度) | |
| 苯基(2,4,6-三甲基苯甲酰基)磷酸锂 (LAP, FluidicLab) | |
| 葡聚糖(Dextran，FluidicLab) | |
| PBS缓冲液粉末(Macklin，D854533-10EA) | |
| 耗材 | 离心管(Falcon 15 mL REF 352097)若干 |
| 离心管(1.5 mL, Axygen)若干 | |
| PTFE管(内/外径0.6 /1.6 mm) 及1/4-28螺纹接头卡箍若干 | |
| 针式过滤器(PTFE,腾津,25 mm×0.22 μm)若干 | |
| 2 mL注射器若干 | |
| 芯片夹具 | PDMS-SCE-50芯片 (FluidicLab) |
| PDMS标准芯片夹具 | |
| 设备 | Fluidiclab微滴/微球制备仪(三通道) |
| 辅助设备 | 电脑(Win10 以上系统) |
| 高速离心机(湖南湘仪, H1850) | |
| 普通光学显微镜(用于测微球粒径) | |
| 超声波清洗机(语盟，YM-020T) | |
| 常规紫外灯(405 nm光源) | |
| 恒温箱(FluidicLab) |
实验步骤：
1.试剂准备
（1）0.25% LAP 水溶液(w/v)配制
取0.01 g LAP粉末，加入4 mL PBS缓冲液，避光超声振荡溶解。
（2）水相1(15%葡聚糖)配制
取0.12 g葡聚糖粉末，加入0.8 mL PBS缓冲液，超声振荡溶解，针式过滤器过滤处理。
（3）水相2(10% GelMA)配制
取0.25 g GelMA固体，加入2.5 mL 0.25% LAP水溶液，避光45 ℃超声振荡溶解，针式过滤器过滤处理。
2.微滴制备及固化
(1) 微滴/微球制备仪的安装连接
微滴/微球制备仪安装连接参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“2. 微滴/微球制备仪的安装连接”的部分；其连接如下(步骤③-⑦连接效果如下图所示)：
① 将微滴/微球制备仪放置于39 ℃恒温箱中；
② 用气管依次连接“空气压缩机”--“气源处理装置”--“微滴/微球制备仪”；
③ 将微滴/微球制备仪分别与电源、电脑的连接；
④ 用气管分别将A0(压力输出通道一)和A1(1.5 mL储液池)，B0(压力输出通道二)和 B1(15 mL储液池)，C0(压力输出通道三)和C1(15 mL储液池)连接；
⑤ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PTFE管(内/外径 0.6 mm/1.6 mm)分别将A1(1.5 mL储液池)和A2(通道一流量传感器)，B1(15 mL储液池)和B2(通道二流量传感器)，C1(15 mL储液池)和 C2(通道三流量传感器)连接；
图9-1 微滴/微球制备仪的安装连接
⑥ 用配有1/4-28螺纹接头和卡箍的PTFE管(内/外径 0.6 mm/1.6 mm)分别将A2(通道一流量传感器)和A3(PDMS芯片的水相1入口)，B2(通道二流量传感器)和B3(PDMS芯片的水相2入口)，C2(通道三流量传感器)和C3(PDMS芯片的油相入口)连接；
⑦ D为标准PDMS芯片和夹具的组合，芯片和夹具的入口通过硅胶塞密封；
⑧ 用PTFE管(内/外径 0.6 mm/1.6 mm)将芯片出口E处生成的乳液导出。
(2) FluidicLab Suite软件的安装和设备的添加：
FluidicLab Suite软件的安装参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.1 FluidicLab Suite软件的安装”的部分；
(3) 微液滴的制备及固化
具体操作步骤如下：
① 在1.5 mL储液池(通道一)，15 mL储液池(通道二)和15 mL 储液池(通道三) 中依次加入水相1(15%葡聚糖溶液)，水相 2(10% GelMA溶液)和10 mL微滴生成油；
② FluidicLab Suite软件的设备添加参考《微滴/微球制备仪使用手册V.1.0》中“3.2 FluidicLab Suite软件的设备添加”的部分(相机和流量传感器仅需添加一次)；
③ 打开空气压缩机和气源处理装置开关；
④ 在乳液出口端放置离心管接收微滴稳定前的废液；
⑤ 在电脑端设置通道一压力(水相1，如100 mbar)、通道二压力(水相2，如100 mbar和通道三压力(油相，如70 mbar)，排出管路和芯片中的空气；
⑥ 待管路和芯片中完全填充液体后(空气被完全排出)，将整个系统由压力控制切换到流速控制，并设置通道一(水相1)、通道二(水相2)和通道三(油相)流速分别为0.6 μL/min，1.8 μL/min和8 μL/min(同“半透膜微胶囊 (SPCs)制备”视频，该油相流速数据为校准数据)；
⑦ 调整反馈值(Feedback)快速达到设定流速，并实现流速的稳定输出；
⑧ 用疏水培养皿接收一滴乳液，并在普通光学显微镜下观察其微滴的均匀性；
⑨ 待微滴生成均匀后，即可开始接收至透明的1.5 mL离心管中；
⑩ 30 min后停止收集，密封于离心管中，用405 nm紫外灯照射1 min固化。
3.破乳清洗
具体操作步骤如下：
① 去除1.5 mL离心管底部微滴生成油；
② 按V球：V破=1:2 加入破乳剂，振荡破乳；
③ 1000 rpm离心处理1 min，并去除底部破乳剂；
④ 重复上述②和③操作将白色乳液洗至透明(重复约5次)；
⑤ 在离心管中加入PBS缓冲液，振荡离心多次洗涤处理；
⑥ 得到固化后的微胶囊最终分散于PBS缓冲液中。
注意：若含有球的水相中仍有部分油乳液存在，可通过细胞筛过滤去除油的乳液或者离心后从上部取出含有微球的水相。
4.微滴/微球制备仪清洗：
微滴/微球制备仪每次使用完必须清洗管路、流量传感器和芯片。具体操作详见“微滴/微球制备仪操作指导卡”。
结果与讨论：
刚接收的核壳结构液滴囊壳平均粒径：49.90 μm，变异系数(CV)：0.92%；囊核平均粒径：32.16 μm，变异系数(CV)：3.49%。其显微镜图和粒径分布如下图10-2所示。
图10-2 固化前微胶囊显微镜图和粒径分布图
图10-3 固化后微胶囊显微镜图和粒径分布图
固化后的核壳结构微胶囊壳平均粒径：59.76 μm，变异系数(CV)：3.10%；囊核平均粒径：48.46 μm，变异系数(CV)：3.33%。其显微镜图和粒径分布如上图3所示。
实验关键要点：
1.含有光引发剂LAP的GelMA溶液在配制与使用全程须严格避光，如用棕色离心管储存，防止提前聚合失效；
2.微球效果可用显微镜观察确认，若镜下无成型微球，即为微滴固化失败，需及时排查实验条件；
3.微滴生成及样品接收过程保持39℃恒温，避免GelMA低温堵塞芯片管路，同时保证双水相充分相分离；
4.实验重复性存在波动，该实验方案仅供参考。
参考文献：
[1] Stuart T., et al. Integrative single-cell analysis. Nat Rev Genet ,20, 257–272 (2019).
[2] Klein A. M., et al. Droplet barcoding for single-cell transcriptomics applied to embryonic stem cells. Cell, 161,1187-1201(2015).
[3] Macosko E. Z., et al. Highly parallel genome-wide expression profiling of individual cells using nanoliter droplets. Cell, 161, 1202–1214 (2015).
[4] Leonaviciene G., et al. Multi-step processing of single cells using semipermeable capsules. Lab Chip, 20, 4052–4062 (2020).
[5] Kim B., et al. Microfluidic production of semipermeable microcapsules by polymerization-Induced phase separation. Langmuir, 31, 6027–6034 (2015).
[6] Baronas D., et al. High-throughput single-cell omics using semipermeable capsules. Science, 391, 1138-1145(2026).
[7] Mazelis I., et al. Multistep genomics on single cells and live cultures in subnanoliter semipermeable capsules. Science, 391, 1130-1137(2026).
公安备案号31011002005499