微流控技术前沿：如何制作适用于10X Genomics体系的barcode gel beads？

声明

以下所有的内容都来自公开数据或者通过对公开数据的合理推测，不保证准确性。

10X单细胞建库试剂中*核心、壁垒*高，也是直接决定建库反应成本的试剂就是barcode gel beads，其作用是和单个细胞包裹在微滴中，在微滴中对所有来源于该细胞的mRNA在反转录和扩增过程中加上特定的barcode序列，从而在后续的测序结果定位来自同一细胞的mRNA。

以下均为推测：

1.10X中用的gel beads的骨架为：Acrylamide和BAC（N,N- bis(acryloyl)cystamine）通过交联而成，浓度6%。

2.基础引物通过5'端Acrydite的修饰共价偶联在gel beads的骨架上。

3.通过DTT还原gel beads中的二硫键，可以将gel beads溶解，从而释放出其上面带的DNA探针，和细胞裂解释放的RNA结合（见视频1和视频2）。

4.直径在50 µm，Cv值在4%左右（见图1），密度为7000-10000个/µl，带有的DNA探针浓度为5-8 µM （见图2）。

推测Gel beads上的序列如下：

推测其cell barcode和UMI序列如下：

推测其连接barcode的方法如下：

（10X专利中报道的为2 bp overhang，该方法中为4 bp overhang）：

但是常规的连接酶的活性需要DTT维持，这和维持gel beads稳定相互矛盾，因此推测其用了特殊的连接酶或者特殊的反应体系。

另外一个方法是通过PCR的方法添加barcode，但是缺点是间隔的引物序列过长，*终的barcode探针序列会超过100 bp。

推测其纯化gel beads的方法如下：

使用dsDNA酶消化未连接成功的含有粘末端的DNA。核酸内切酶因为buffer体系中存在DTT，可能不适合用于此体系下。

推测其质检方法如下：

1.琼脂糖电泳，看全长的DNA片段的比例；

2.使用bioanalyzer看全长的DNA片段的比例；

3.使用FAM-Probe看不同区段的杂交信号，然后上流式细胞仪看信号。