海藻酸盐微球包载脂质纳米颗粒

一、实验目的

脂质纳米颗粒（Lipid Nanoparticle，LNP）是核酸及小分子药物递送的重要载体，但游离 LNP 单独递送时存在易聚集融合与药物泄漏，体内易被网状内皮系统快速清除、循环半衰期短，以及药物突释、局部滞留差、利用率低等不足。以天然、可降解、生物相容性优异的海藻酸钠为载体制备凝胶微球并将 LNP 包载其中，其三维网状骨架既可固定、保护 LNP，抑制聚集并缓解酶解、降低免疫清除速率，又能与 LNP 形成双重释放屏障，实现缓释控释、抑制突释、增强局部滞留，从而提高局部药物浓度、延长作用时间并降低全身毒副作用。

基于此，本实验使用 FluidicLab NP-S2 Pro 智能微纳米颗粒合成仪，首先制备以 SM102 为主要可电离脂质的 LNP，再构建稳定的海藻酸钠微球–LNP 复合体系，并采用 DiD 荧光染料对 LNP 在微球中的包载效果进行初步验证。

二、实验原理

SM102 是一种可用于人体的可电离阳离子脂质，在酸性条件下可发生质子化而带正电。本实验采用微流控混合法，使脂质相在微混合器中快速、充分且高度可重复地混合，形成粒径可控的 LNP。

DiD 属于亲脂性羰花青类荧光染料，其分子两端各带有一条十八烷基疏水碳链，可像“尾巴”一样插入脂质双分子层内部的疏水脂肪酸区域，荧光发色基团则停留在靠近膜–水界面的位置，适用于对脂质膜进行荧光示踪。

海藻酸盐微球以天然海洋褐藻提取物——海藻酸钠为核心原料，具有无毒、无刺激、生物相容性优异、可自然生物降解等特点。本实验采用液滴微流控技术，以微滴生成油为油相，以含有 Ca-EDTA 螯合物和海藻酸钠的溶液为水相制备单分散微液滴，并将其接收至含乙酸的接收相中固化；在酸性条件下 Ca-EDTA 释放 Ca²⁺，与海藻酸钠发生离子交联，从而制得高单分散性的海藻酸盐凝胶微球。

三、实验步骤

（一）纳米颗粒制备

1.试剂配制

复方磷脂溶液与柠檬酸缓冲液的配制方法同 FluidicLab 官网实验方案（https://www.fluidiclab.com/mrna-lnp-s1/）。为便于观察实验结果，在配制好的复方磷脂溶液中加入 DiD 染料，使其终浓度为 0.5%（w/w）。

2.LNP 制备及后处理

使用 FluidicLab NP-S2 Pro 合成 LNP，合成体系参数如表 1 所示；详细操作步骤可参考 FluidicLab 官网实验方案（https://www.fluidiclab.com/mrna-lnp-s1/）。

表 1  LNP 合成体系参数

3.LNP 表征

采用动态光散射仪（Dynamic Light Scattering，DLS）分别测定 LNP 透析（纯化）前后的粒径分布及多分散指数（PDI），以考察纯化过程对粒径的影响。结果显示，透析前后 LNP 均呈单峰分布，峰形尖锐、粒径均一、重复性良好（图 1）。

图 1  LNP 透析前后的粒径分布（DLS）：左为透析前，右为透析后

（二）微球包载纳米颗粒

1.水相溶液配制（1% 海藻酸钠，120 mM Ca-EDTA）

取 1 倍体积的 4% 海藻酸钠溶液，加入至 2 倍体积的 240 mM Ca-EDTA 溶液中，振荡混匀后经针式过滤器过滤备用；再取 1 倍体积的 LNP 加入上述滤液中，振荡混匀，即得微球制备水相。

示例：取 1 mL 的 4% 海藻酸钠溶液加入 2 mL 的 240 mM Ca-EDTA 溶液中，振荡混匀并过滤，之后再加入 1 mL LNP，即得微球制备水相（终浓度为 1% 海藻酸钠、120 mM Ca-EDTA）。

2.微球包载纳米颗粒制备

微球包载纳米颗粒的制备同样在 NP-S2 Pro 微纳米颗粒合成仪上进行：油相采用 FluidicLab 微滴生成油，水相为上述配制好的含 LNP 海藻酸钠溶液。在适配器中装入微滴制备芯片，通过控制软件实时观察微滴生成状态，并调节工艺参数制备目标粒径的微滴（图 2）。

图 2  微滴生成过程控制软件界面（流速控制与实时画面）

微滴经接收、固化后得到海藻酸钠微球。经测量，固化后微球的平均粒径为 73.52 μm，CV 值为 3.62%，粒径均一、圆度良好（图 3）。

图 3 .固化后海藻酸钠微球的显微镜图及粒径分布

在 644 nm 激发波长下，经荧光显微镜观察，包载 DiD 标记 LNP 的海藻酸钠微球发出明显的红色荧光，而未包载 LNP 的空白微球无荧光信号，表明 LNP 已成功包载于海藻酸钠微球内部（图 4）。